□ 張倩瑤 梁世君 桐廬縣檢驗(yàn)檢測(cè)中心

大豆糖蜜的主要成分是糖，含量在58%～65%，包括低聚糖、二糖和少量單糖。次要成分包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、礦物質(zhì)、大豆皂苷（6%～15%）、大豆異黃酮（0.8%～2.5%）和其他有機(jī)成分，包括酚酸，無(wú)色花青素等[1]。

異黃酮僅存在于豆科的蝶形花亞科[2]等少數(shù)植物中。目前鑒于異黃酮具有雌激素類性質(zhì)，因?qū)θ梭w健康有益而被廣泛關(guān)注[3]。大豆糖蜜作為異黃酮的豐富來(lái)源，關(guān)于其的提取與富集研究文獻(xiàn)主要是一些專利，國(guó)內(nèi)相關(guān)的研究報(bào)道還不是很多[4]。

大豆皂苷毒副作用很小，并且具有很多有益的生理功能[5]。隨著大豆皂苷在食品領(lǐng)域應(yīng)用的增加和其眾多的有益生理功效，其商業(yè)價(jià)值正逐漸得到人們的重視，這也就促進(jìn)了對(duì)大豆皂苷產(chǎn)品生產(chǎn)提取工藝的研究。

超聲輔助提取技術(shù)的原理是超聲波傳播過(guò)程中產(chǎn)生的強(qiáng)烈空化、擾動(dòng)效應(yīng)，可增大提取溶劑中物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，增強(qiáng)溶劑穿透力，從而加速提取溶劑中的目標(biāo)成分進(jìn)入溶劑，促進(jìn)提取的進(jìn)行。目前，超聲輔助提取技術(shù)被廣泛應(yīng)用于油脂提取、食品添加劑、食品原料中活性成分[6]和糖類物質(zhì)等的提取分離。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.9%，購(gòu)于sigma 公司），大豆糖蜜由山東萬(wàn)德福實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司提供，Waters 600 高效液相色譜儀（美，Waters 公司），臺(tái)式離心機(jī)TPL—5（上海安亭科學(xué)儀器廠），KJ—300 超聲波發(fā)生器（無(wú)錫市科潔超聲電子設(shè)備有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 RE—52（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

大豆糖蜜（粘稠液體狀）經(jīng)過(guò)稀釋、酸沉、離心后得到大豆糖蜜沉淀，沉淀經(jīng)冷凍干燥后得到大豆糖蜜沉淀干粉，為實(shí)驗(yàn)原料。

大豆皂苷含量的測(cè)定：香草醛—高氯酸法[7]。

大豆異黃酮總量測(cè)定：外標(biāo)法，HPLC法[8]，反向色譜柱，C18柱250 mm×4.6 mm×5 μm；流動(dòng)相，A 相：三氟乙酸—乙腈溶液，三氟乙酸體積分?jǐn)?shù)為0.5%；B 相：三氟乙酸水溶液（三氟乙酸體積分?jǐn)?shù)0.05%）；檢測(cè)器類型：紫外檢測(cè)器；測(cè)定波長(zhǎng)，254 nm；色譜柱溫度，34 ℃；洗脫方式：梯度洗脫；流速，1 mL/min；進(jìn)樣量，20 μL。

脂類測(cè)定：氯仿甲醇法[9]。

總糖含量測(cè)定：苯酚—硫酸法[10]。

1.2.1 超聲輔助提取異黃酮

準(zhǔn)確稱取一定量的經(jīng)冷凍真空干燥后的大豆糖蜜沉淀粉末，按照一定的料液比加入90%丙酮—水溶液，在設(shè)定溫度下經(jīng)超聲提取一段時(shí)間后，過(guò)濾，濾渣再用相同體積分?jǐn)?shù)溶液在普通磁力攪拌下提取1 h，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去丙酮，測(cè)定其異黃酮總量，3 次重復(fù)。分別考察超聲功率(超聲頻率為20 kHz)、料液比、提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響，得到最佳的超聲輔助提取條件。

1.2.2 回流提取皂苷

提取異黃酮后的濾渣，改變丙酮和水比例，調(diào)節(jié)pH 值，在一定溫度下，加熱回流提取皂苷，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去丙酮，測(cè)皂苷含量。

1.2.3 提取率和純度的計(jì)算

提取率和純度按照公式（1）和(2)計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆糖蜜沉淀成分分析

由表1 可以看出，大豆糖蜜經(jīng)酸沉后，異黃酮和皂苷的含量（一般糖蜜中異黃酮含量為0.8%～2.5%，皂苷含量為6%～15%）有所上升。這主要是由于大豆糖蜜中含有大量的碳水化合物，主要是一些水溶性的糖類，而低聚糖和單糖、雙糖等是不帶電荷的，所以在酸性條件下不會(huì)沉淀下來(lái)。皂苷和異黃酮以及大部分磷脂、植酸、酚酸等分子帶負(fù)電荷，在酸性條件下因形成聚集體而沉淀下來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)了初步富集。酸沉沉淀中，異黃酮和皂苷含量高，適合作為提取異黃酮和皂苷的原料。

表1 大豆糖蜜沉淀成分分析

2.2 超聲功率對(duì)異黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取糖蜜沉淀干粉6 份，每份10 g，按照料液比1 ∶10 加入一定體積分?jǐn)?shù)的丙酮水溶液，室溫條件下，在頻率20 kHz，不同功率條件下超聲30 min，除去丙酮，測(cè)定提取液中的異黃酮總量。比較超聲功率對(duì)異黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 超聲功率對(duì)異黃酮提取率的影響

由圖1 可以看出，當(dāng)超聲功率在150 W 時(shí)，異黃酮的提取率達(dá)到最大，過(guò)高和過(guò)低都會(huì)降低異黃酮的提取率。這可能是由于超聲功率越低，超聲產(chǎn)生的機(jī)械作用越弱，而功率過(guò)高時(shí)，產(chǎn)生的空化效應(yīng)弱，有效成分的溶出不充分，在空化作用的最佳結(jié)合點(diǎn)上，有效成分溶出最完全，總異黃酮提取率最大[11]。因而確定150 W 為適宜的提取功率。

2.3 超聲時(shí)間對(duì)異黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取糖蜜沉淀干粉6 份，每份10 g，按照料液比1 ∶10 加入一定體積分?jǐn)?shù)的丙酮水溶液，室溫條件下，頻率20 kHz，功率150 W 條件下超聲不同時(shí)間，除去丙酮，測(cè)定提取液中異黃酮總量。比較超聲時(shí)間對(duì)異黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)異黃酮提取率的影響

由圖2 可以看出，隨著超聲時(shí)間的增加，異黃酮提取率呈上升趨勢(shì)，但在30 min 后，異黃酮提取率隨著提取時(shí)間的增加而呈下降趨勢(shì)。造成異黃酮提取率下降的原因可能是在長(zhǎng)時(shí)間超聲作用下，丙二?；蠖管盏幕钚曰鶊F(tuán)遭到破壞，降解為糖苷型異黃酮，糖苷型異黃酮的羥基也容易發(fā)生反應(yīng)而被破壞，降低了總異黃酮含量，從而提取率呈降低趨勢(shì)。這在不同時(shí)間提取液中異黃酮的HPLC 圖譜中也可以看出。

國(guó)外文獻(xiàn)中也有報(bào)道提出，在提取異黃酮時(shí)，長(zhǎng)時(shí)間的超聲會(huì)造成羥自由基發(fā)生反應(yīng)，從而使目標(biāo)產(chǎn)物發(fā)生降解[12]。因此30 min 是能達(dá)到較高異黃酮提取率的最佳時(shí)間。

2.4 料液比對(duì)異黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取糖蜜沉淀干粉5 份，每份10 g，按照不同料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)的丙酮水溶液，室溫條件下，頻率20 kHz，不同功率條件下超聲30 min，濾液除去丙酮，測(cè)定提取液中異黃酮總量。比較超聲功率對(duì)異黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 料液比對(duì)異黃酮提取率的影響

由圖3 可以看出，隨著料液比的增加，異黃酮提取率逐漸增加，但1 ∶20 與1 ∶30 的提取率相差不大，提取液用量大也會(huì)相應(yīng)的增加成本，所以選用1 ∶20 的料液比作為超聲提取的最佳料液比。

2.5 異黃酮和皂苷提取工藝條件的確定

丙酮是一種弱極性有機(jī)溶劑，對(duì)異黃酮有較高的溶解度[13]。而皂苷的分子量較大，極性大，易溶于極性較大的溶劑中。所以可以通過(guò)控制調(diào)節(jié)丙酮和水的比例以及調(diào)節(jié)不同的pH 值，分步提取異黃酮和皂苷，得到兩者的粗品，為下一步的分離純化提供方便。得出的具體工藝流程和工藝條件見(jiàn)圖4。

圖4 提取異黃酮和皂苷的工藝流程

2.6 最佳工藝條件下提取異黃酮和皂苷

在最佳工藝條件下分步提取得到異黃酮和皂苷粗品，分別旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去丙酮后凍干樣品，測(cè)定粗品的質(zhì)量以及異黃酮和皂苷的含量，并計(jì)算得到異黃酮粗品和皂苷粗品中異黃酮和皂苷的純度以及提取率，如表2。

3 結(jié)論

本文研究了用丙酮水溶液作為提取溶劑，超聲輔助提取，后加熱回流提取異黃酮和皂苷，得到了較高提取率和純度的異黃酮和皂苷粗品。

1.一定比例的丙酮水溶液作為異黃酮的良好溶劑，在超聲輔助提取下，異黃酮的提取率達(dá)到85.96%，純度為11.48%。

表2 異黃酮和皂苷的提取率與純度

2.改變丙酮和水的比例，調(diào)節(jié)pH值，將濾渣進(jìn)一步提取，可達(dá)到提取率為 76.91%，純度為57.80%的皂苷粗品。

3.提取溶劑丙酮可回收再利用，對(duì)環(huán)境污染小，兩次分步提取可得到異黃酮和皂苷粗品，工藝過(guò)程簡(jiǎn)單，提取率高，可進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。