杜一鳴 鐘 原 尚宏芹 成仿云*

(1.北京林業(yè)大學林木分子設計育種高精尖創(chuàng)新中心，牡丹國際研究院，國家花卉工程技術(shù)中心，園林學院，北京 100083；2.菏澤學院農(nóng)業(yè)與生物工程學院，菏澤 274015)

牡丹是我國傳統(tǒng)名花，集觀賞、藥用、油用、文化載體等重要價值于一體，是一類極具綜合開發(fā)潛力的物種。近年來研究表明，牡丹種子產(chǎn)量高、且富含食用油中缺少的不飽和脂肪酸尤其是α-亞麻酸，因此牡丹作為一種優(yōu)良的木本油料資源受到市場的廣泛關(guān)注[1～2]。然而，傳統(tǒng)繁殖方法如嫁接、分株等嚴重制約了其繁殖效率和育種進程，如何建立一種高效穩(wěn)定的體外再生體系是牡丹育種和產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟待解決的問題。

組織培養(yǎng)是離體快繁和利用基因工程進行遺傳改良的重要基礎之一。在牡丹中，組織培養(yǎng)一直受到廣泛關(guān)注，以往的研究主要涉及微繁殖[3～4]、胚培養(yǎng)[5]、體胚直接發(fā)生[6]及愈傷組織誘導與分化[7～8]等方面，但由于存在玻璃化、生根困難、增殖率低、褐化等許多問題，目前尚未建立起可應用于實際生產(chǎn)和遺傳轉(zhuǎn)化的再生體系。愈傷組織再生體系是最常用的遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)之一[9]，牡丹愈傷組織雖然可使用多種外植體如子葉[10]、葉柄[7]、葉片、莖段、花瓣、花藥等[8]誘導獲得，但愈傷組織的分化十分困難，僅有少量不定芽或球形胚分化，因此，如何誘導胚性愈傷組織并促進其分化是牡丹組織培養(yǎng)技術(shù)研究的關(guān)鍵。

本研究中，我們嘗試開發(fā)一種新的外植體。利用花絲為外植體進行體外再生在許多植物中獲得了成功，如葡萄[11]、費約果[12]、黃花七葉樹[13]等，而牡丹花絲在愈傷組織誘導中幾乎沒有應用。前期預實驗表明，相較于其他外植體，花絲對愈傷組織誘導反應良好，且對發(fā)育時期要求不那么嚴格，在花絲著色變紅之前的各時期均有很高的愈傷組織誘導率；花絲取材數(shù)量多，操作方便，是一類良好的外植體來源。因此，本文采用“鳳丹”幼嫩花絲作為外植體，探究了發(fā)育時期、基本培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑(plant growth regulators,PGRs)對花絲愈傷組織誘導、增殖及分化的影響，并進行了愈傷組織的組織學分析，以期為牡丹體外再生體系的建立提供基礎和參考。

1 材料和方法

1.1 外植體制備

試驗所用的“鳳丹”牡丹均來自北京延慶國色牡丹園，于2019年3月30日至4月20日，每隔5 d采一次“鳳丹”花蕾，共采樣5次，各時期花蕾直徑分別為13.65 mm±0.14 mm、16.17 mm±0.30 mm、18.62 mm±0.23 mm、22.07 mm±0.57 mm、25.22 mm±0.13 mm(見圖1A)。將整個花蕾置于塑料瓶中，洗滌精浸泡5 min，流水沖洗10 min，轉(zhuǎn)至超凈工作臺上，75%乙醇消毒1 min，3%次氯酸鈉消毒2次，每次5 min，無菌水沖洗3～5遍，然后置于無菌濾紙上，用鑷子和手術(shù)刀剝出花絲，切成3～5 mm，做為外植體，接種至愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，每皿20～25個(見圖1B)，每個花蕾處理6皿。

圖1 不同發(fā)育時期的“鳳丹”花蕾及花絲啟動培養(yǎng) A.不同發(fā)育時期的“鳳丹”花蕾(除去花被)，從左至右分別為1～5時期；B.花絲啟動培養(yǎng)Fig.1 Flower bud at different developmental stages of P.ostii ‘Feng Dan’ and initiation culture of the filaments A.Flower bud at different developmental stages of P.ostii ‘Feng Dan’(the perianth were removed),1-5 periods from left to right,respectively; B. Initiation culture of the filaments

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

將1～5發(fā)育時期的花絲分別接種至MS培養(yǎng)基，添加1.0 mg·L-12,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)、1.0 mg·L-1萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid，NAA)、0.5 mg·L-16-芐氨基腺嘌呤(6-Benzyladenine，BA)、水解酪蛋白(Casein hydrolysate，CH)500 mg·L-1、蔗糖30 g·L-1、瓊脂6.5 g·L-1，探究發(fā)育時期對花絲愈傷組織誘導的影響。根據(jù)試驗結(jié)果，選取直徑為13～19 mm，半透明或白色的花絲為外植體，進行以下試驗。

愈傷組織誘導采用L9(34)正交設計，包括培養(yǎng)基(MS、SH、DKW)、2,4-D(0、1.0、2.0 mg·L-1)、NAA(0、1.0、2.0 mg·L-1)、BA(0.1、0.2、0.5 mg·L-1)，共9個處理，均添加CH 500 mg·L-1、蔗糖30 g·L-1、瓊脂6.5 g·L-1。

愈傷組織增殖采用SH培養(yǎng)基，添加2,4-D(0.1～1.0 mg·L-1)、NAA(0.1～1.0 mg·L-1)、BA(0.05～0.25 mg·L-1)，以及CH 500 mg·L-1、蔗糖30 g·L-1、維生素C 20 mg·L-1、AgNO35 mg·L-1、瓊脂6.5 g·L-1。

愈傷組織分化采用MS培養(yǎng)基，添加不同濃度的毒莠啶(Picloram，PIC)、NAA、BA、噻苯隆(Thidiazuron，TDZ)、氯吡苯脲(N-(2-chloro-4-pyridyl)-N-phenylurea，CPPU)，以及CH 500 mg·L-1、蔗糖80 g·L-1、瓊脂8.0 g·L-1。

所有培養(yǎng)基pH調(diào)至5.8，120℃下滅菌20 min。愈傷組織誘導和增殖在黑暗條件下，分化培養(yǎng)在16 h·d-1光照條件下，光照強度為50 μmol·m-2·s-1，光源為LED(70%紅光+30%藍光)。培養(yǎng)溫度均為23℃，繼代周期為20 d。

1.3 組織切片制作

對不同處理的愈傷組織進行石蠟切片制作及顯微觀察，具體步驟為FAA固定→乙醇梯度脫水→二甲苯透明→浸蠟→包埋→切片→粘片→染色→封片，切片厚度為8 μm，染色采用蘇木精—伊紅及番紅復染，切片機型號為LEICA RM2245，顯微鏡型號為LEICA ICC50 HD。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

誘導培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計愈傷誘導率和誘導量，增殖培養(yǎng)兩代后統(tǒng)計增殖系數(shù)，分化培養(yǎng)90 d統(tǒng)計分化率。數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0進行方差分析和鄧肯多重檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)育時期對“鳳丹”花絲愈傷組織誘導率的影響

將不同發(fā)育時期的花絲接種至培養(yǎng)基中，觀察愈傷組織誘導情況。1～3時期為雄蕊發(fā)育早期，此時花藥呈淡黃色，花絲呈半透明或白色，這3個時期的花絲均獲得了較高的愈傷組織誘導率，最高為第3時期，為87.50%±4.17%，3個時期的誘導率無顯著差異。第4和第5時期的花絲逐漸變紅老化，伴隨著花絲愈傷組織誘導率顯著下降(見表1)，表明1～3時期較幼嫩的花絲更適宜愈傷組織的誘導。

表1 發(fā)育時期對“鳳丹”花絲愈傷組織誘導率的影響

Table 1 The effect of filament developmental stage on callus induction rate ofPaeoniaostii‘Feng Dan’

花絲發(fā)育時期Filamentdevelopmentalstage12345誘導率Inductionrate(%)80.00±0.00a80.00±2.00a87.50±4.17a29.27±11.38b18.87±7.63b

注：表中小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，下同。

Note:different letters show significant differences at 0.05 level,the same as below.

2.2 基本培養(yǎng)基和PGRs對“鳳丹”花絲愈傷組織誘導的影響

將花絲接種至誘導培養(yǎng)基約15 d，從花絲兩端切口處開始形成愈傷組織，然后逐漸包圍外植體。除1號處理的外植體褐死外，其余各處理均得到了較高的愈傷組織誘導率。不同處理間愈傷組織誘導率和誘導量差異顯著，其中7號處理愈傷組織誘導率和誘導量均為最高，誘導率可達99.12%±2.15%，誘導量為5.68 g±1.42 g(表2)。方差分析表明，基本培養(yǎng)基、2,4-D、NAA及BA對“鳳丹”花絲愈傷組織誘導率和誘導量均有顯著影響。對于誘導率來說，各因素的主效應為BA>基本培養(yǎng)基>2，4-D>NAA，各因素的最佳水平分別為2,4-D 2 mg·L-1、NAA 2 mg·L-1、0.2 mg·L-1BA及SH培養(yǎng)基，但由于各因素的K2和K3之間沒有顯著差異，在誘導過程中可選擇較低濃度的PGRs，即1 mg·L-12,4-D、1 mg·L-1NAA及0.2 mg·L-1BA；而對于誘導量來說，各因素的主效應為基本培養(yǎng)基>BA>NAA>2，4-D，各因素的最佳水平分別為2,4-D 2 mg·L-1、NAA 2 mg·L-1、0.5 mg·L-1BA及SH培養(yǎng)基，由于2,4-D和BA的K2和K3之間沒有顯著差異，在實驗中可選用較低的濃度，即1 mg·L-12,4-D和0.2 mg·L-1BA。綜合考慮誘導率和誘導量，“鳳丹”花絲愈傷組織誘導最適培養(yǎng)基為SH培養(yǎng)基、1 mg·L-12,4-D、2 mg·L-1NAA及0.2 mg·L-1BA(表3～4)。

表2 基本培養(yǎng)基和PGRs對“鳳丹”花絲愈傷組織誘導的影響

表3 “鳳丹”花絲愈傷組織誘導率和誘導量的方差分析

表4 “鳳丹”花絲愈傷組織誘導率和誘導量的多重比較和極差

2.3 “鳳丹”花絲愈傷組織形態(tài)組織學觀察

“鳳丹”花絲愈傷組織按照形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)可分為三類：Ⅰ類愈傷組織外觀金黃色或亮黃色，質(zhì)地較松軟，水分含量較高(見圖2:A～B)；Ⅱ類愈傷組織生長量大，黃白色或黃色，質(zhì)地較硬，表面較光滑或呈顆粒狀，部分表面有細碎白色愈傷(見圖2:C～E)；Ⅲ類愈傷組織生長量小，黃褐色或褐色，培養(yǎng)過程中逐漸褐化，較致密，表面呈細小顆粒狀(見圖2:F～H)。組織學研究表明Ⅰ類愈傷組織主要由胚性細胞組成，表現(xiàn)為細胞核大，細胞質(zhì)濃，核質(zhì)比高，呈現(xiàn)顯著的分生細胞特征(見圖3:D,G)；Ⅱ類愈傷組織由胚性細胞和非胚性細胞組成，整個外植體靠近表皮的部位，分布大量的胚性細胞，并形成許多小的突起。在這類愈傷組織內(nèi)部，存在許多非胚性細胞，此外還有大量的維管組織分化，呈團狀或片狀，有的維管組織周圍有薄壁細胞包圍，形成分生結(jié)節(jié)(見圖3:E,H)。Ⅲ類愈傷組織結(jié)構(gòu)介于Ⅰ類和Ⅱ類之間，在愈傷組織表層和內(nèi)部均存在大量胚性細胞，愈傷組織表面有許多胚性細胞形成的突起，同時，愈傷組織內(nèi)部存在大量維管組織及分生結(jié)節(jié)的分化(見圖3:F,I)。

本研究發(fā)現(xiàn)愈傷組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的差異主要與基本培養(yǎng)基種類相關(guān)，Ⅰ類愈傷組織主要是在MS培養(yǎng)基上產(chǎn)生，Ⅱ類愈傷組織是在SH培養(yǎng)基上產(chǎn)生，而Ⅲ類愈傷組織是在DKW培養(yǎng)基上產(chǎn)生，表明相對于PGRs來說，基本培養(yǎng)基的組分對愈傷組織類型具有更為顯著的影響。

2.4 “鳳丹”花絲愈傷組織的增殖

PGRs濃度和配比對“鳳丹”花絲愈傷組織增殖率具有顯著影響，在添加0.5 mg·L-12,4-D、0.5 mg·L-1NAA及0.25 mg·L-1BA的SH培養(yǎng)基上，愈傷組織增殖系數(shù)最高，為3.81±0.97，在不添加任何PGRs的培養(yǎng)基上，增殖系數(shù)最低，為1.84±0.75。愈傷組織誘導培養(yǎng)基對愈傷組織增殖也有顯著影響，除1號培養(yǎng)基未產(chǎn)生愈傷組織，3、4及8號培養(yǎng)基愈傷組織在繼代過程中逐漸褐死外，其余各處理的愈傷組織用來進行增殖試驗，其中5號培養(yǎng)基上產(chǎn)生的愈傷組織具有最高的增殖率，為3.86±0.58，表明其具有最高的分裂活性(見表5)。

表5 PGRs和啟動培養(yǎng)基對“鳳丹”花絲愈傷組織增殖的影響

圖2 不同誘導培養(yǎng)基上的“鳳丹”花絲愈傷組織 A～B. MS培養(yǎng)基上的Ⅰ類愈傷組織，分別來自5號(A)和9號(B)處理；C～E. SH培養(yǎng)基上的Ⅱ類愈傷組織，分別來自2號(C)、6號(D)和7號(E)處理；F～H. DKW培養(yǎng)基上的Ⅲ類愈傷組織，分別來自3號(F)、4號(G)和8號(H)處理Fig.2 Calluses from filaments of P.ostii ‘Feng Dan’ on different induction medium A-B. Type Ⅰ callus on MS medium from No.5(A) and No.9(B) treatment,respectively; C-E. Type Ⅱ callus on SH medium from No.2(C),No.6(D) and No.7(B) treatment,respectively; F-H. Type Ⅲ callus on DKW medium from No.3(F),No.4(G) and No.8(H) treatment,respectively

圖3 “鳳丹”花絲愈傷組織的組織學觀察 A,D,G.Ⅰ類愈傷組織(A.金黃色、質(zhì)地松軟的胚性愈傷組織；D.胚性愈傷組織主要由胚性細胞組成；G.核大質(zhì)濃的胚性細胞)；B,E,H.Ⅱ類愈傷組織(B.黃白色、質(zhì)地堅硬的愈傷組織；E,H.愈傷組織表層分布胚性細胞，形成許多小突起(紅色箭頭)，內(nèi)部有大量維管組織分化(黑色箭頭))；C,F,I.Ⅲ類愈傷組織(C.黃褐色或褐色、質(zhì)地較硬的愈傷組織;F,I.愈傷組織表面有許多胚性細胞形成的突起(紅色箭頭)，內(nèi)部同時存在胚性細胞和非胚性細胞，以及大量維管組織分化(黑色箭頭))Fig.3 Histological observation of calluses from filaments of P.ostii ‘Feng Dan’ A,D,G. Type Ⅰ callus(A. Golden yellow,loose embryogenic callus; D. Embryogenic callus is composed of embryogenic cells; G. embryogenic cells present evident nucleus and dense protoplasm); B,E,H. Type Ⅱ callus(B. Yellow-white and compact callus; E,H. The embryogenic cells were distributed on the surface of callus and formed several small protuberances(red arrows) ,while plenty of vascular tissues were formed inside the callus(black arrow)); C,F,I. Type Ⅲ callus(C. Yellowish brown or brown,compact callus; F,I. Several protuberances were formed on the surface of the callus,which were composed of embryogenic cells,both embryogenic and non-embryogenic cells existed inside the callus,as well as a large amount of vascular tissues(black arrow))

圖4 “鳳丹”花絲愈傷組織分化 A.Ⅰ類愈傷組織上體胚分化；B. Ⅱ類愈傷組織表面形成綠色或紅色突起；C. Ⅱ類愈傷組織上不定芽分化Fig.4 Differentiation of callus from filaments of P.ostii ‘Feng Dan’ A. Somatic embryogenesis from type Ⅰ callus; B. A large number of green or red protuberances formed from type Ⅱ callus; C. Shoots organogenesis from type Ⅱ callus

2.5 “鳳丹”花絲愈傷組織的分化

將“鳳丹”花絲愈傷組織轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上，得到了少量的分化。其中，金黃色、松軟的Ⅰ類胚性愈傷組織，在轉(zhuǎn)入含有0.5 mg·L-1PIC、0.5 mg·L-1BA及80 g·L-1蔗糖的MS培養(yǎng)基2個月后，觀察到了魚雷期體胚的分化，分化率為3%(見表6)。體胚著生于愈傷組織表面，外觀黃色，具有完整的莖端與根端，根部與愈傷組織存在少量連結(jié)，易與愈傷組織分離(見圖4A)。此外，試驗還觀察到了少量不定芽的分化，在含有0.25 mg·L-1NAA、0.5 mg·L-1BA及80 g·L-1蔗糖的MS培養(yǎng)基上，黃白色、質(zhì)地堅硬的Ⅱ類愈傷組織逐漸變成致密的結(jié)節(jié)狀，表面呈綠色或呈紅色(見圖4B)，2個月后得到了5%的不定芽分化率(見表6)，不定芽呈綠色，與體胚具有明顯的形態(tài)結(jié)構(gòu)差異，缺少根端，基部與愈傷組織緊密連結(jié)(見圖4C)。

表6 “鳳丹”花絲愈傷組織分化情況

3 討論

外植體種類和發(fā)育時期是影響植物愈傷組織誘導的重要因素，通常較幼嫩的外植體更適宜進行愈傷組織的誘導和再生[14]。牡丹愈傷組織可由多種外植體產(chǎn)生，紫斑牡丹葉柄愈傷組織誘導率可達100%，進一步誘導得到了分生結(jié)節(jié)[7]；“鳳丹”葉片、莖段、花藥、花瓣愈傷誘導率為50.8%～98.9%，不定芽分化率為22.22%～34.81%[8]；“鳳丹”子葉愈傷組織誘導率可達91.26%[10]，但均未有明顯的體胚分化。幼嫩花絲可作為體外再生的外植體，在葡萄等植物中獲得了愈傷組織及體胚的分化，但在牡丹上很少應用[15]。本研究表明“鳳丹”幼嫩花絲適于進行愈傷組織誘導，誘導率高達99.12%，組織學分析及體胚和不定芽的分化證實了胚性愈傷組織的存在，并首次觀察到了間接發(fā)生的魚雷期體胚，表明“鳳丹”花絲是一種良好的有再生潛力的外植體來源。

培養(yǎng)基組分對植物細胞生長具有重要的影響，不同的植物種類及外植體對培養(yǎng)基的反應具有顯著差異，根據(jù)不同的培養(yǎng)目的，選擇最合適的基本培養(yǎng)基是植物體外再生的必要條件。如針葉樹常用的培養(yǎng)基有LV、mLV及DCR等[16～17]；木本植物常用的WPM和DKW等[18～19]。本研究中，基本培養(yǎng)基組分對“鳳丹”花絲愈傷的誘導率、誘導量及愈傷組織形態(tài)結(jié)構(gòu)均具有顯著的影響。SH培養(yǎng)基上獲得了最高的愈傷組織誘導率和誘導量，但僅在MS培養(yǎng)基上得到了金黃色、質(zhì)地松軟的胚性愈傷組織，而SH和DKW培養(yǎng)基上的愈傷組織質(zhì)地較硬，內(nèi)部存在大量維管組織分化。在后續(xù)繼代分化過程中，這3種愈傷組織的表現(xiàn)也存在明顯的差異，表明基本培養(yǎng)基對植物細胞生長和分化具有重要影響。類似的結(jié)果已有大量報道，在紫斑牡丹愈傷組織及分生結(jié)節(jié)的誘導過程中，SH和1/2MS培養(yǎng)基上的愈傷率要顯著高于WPM培養(yǎng)基，SH培養(yǎng)基上的褐化率則顯著低于另外兩種[7]；在“鳳丹”子葉愈傷組織誘導及分化過程中，MS和1/2MS明顯優(yōu)于WPM、White培養(yǎng)基，僅在MS和1/2MS上觀察到了不定芽的分化[20]。

激素是影響植物細胞生長發(fā)育的關(guān)鍵因素。在植物愈傷組織誘導及分化過程中，生長素和細胞分裂素是最常用的激素，其種類、濃度及配比決定了細胞發(fā)育的方向[9]。本研究中，單獨使用BA，無法誘導花絲愈傷的產(chǎn)生，而在含有2,4-D、NAA的所有培養(yǎng)基上，都得到了較高的愈傷組織誘導率，因此，生長素對于“鳳丹”花絲愈傷的誘導是必需的。2,4-D、NAA、BA濃度對“鳳丹”花絲誘導率和誘導量均有顯著的影響，當2,4-D 1 mg·L-1、NAA 2 mg·L-1、BA 0.2 mg·L-1時，最適于“鳳丹”花絲愈傷組織的誘導；當2,4-D 0.5 mg·L-1、NAA 0.5 mg·L-1、BA 0.25 mg·L-1時，最適于“鳳丹”花絲愈傷組織的增殖。

細胞的內(nèi)部生理狀態(tài)和外部培養(yǎng)條件決定了其發(fā)育方向，只有具有全能性或多能性的細胞才能進行形態(tài)發(fā)生。細胞全能性是指細胞在適當條件下能夠模擬合子胚發(fā)育成一個完整的有機體，如體胚的發(fā)生；多能性是指細胞具有定向發(fā)育成某種器官的能力，如不定芽或不定根形成[9]。本研究觀察到了3種不同形態(tài)結(jié)構(gòu)的愈傷組織，其中都存在胚性細胞區(qū)域，表明它們都具有一定的分化潛力。Ⅰ類愈傷組織具有典型的胚性愈傷組織特征，包括細胞核大質(zhì)濃、核質(zhì)比高、質(zhì)地松軟等，在許多植物中有過類似報道，這類愈傷組織具有分化體胚的潛力[21～22]。本研究也觀察到了魚類形時期的體胚，證實此類愈傷確實具有體胚分化的潛力。Ⅱ類愈傷組織和Ⅲ類愈傷組織結(jié)構(gòu)致密，內(nèi)部呈現(xiàn)大量的維管組織分化，大多數(shù)器官分化的愈傷組織具備此類結(jié)構(gòu)特征[23～24]。在Ⅱ類愈傷組織上，本研究也觀察到了部分不定芽的分化，證實了此類愈傷組織具有器官分化的潛力。Ⅲ類愈傷組織在培養(yǎng)過程中呈褐色，尚未觀察到明顯分化，可能是分化條件不適宜。在未來的研究中，通過改良培養(yǎng)基組分，提高胚性愈傷組織分化率、促進體胚及器官再生是關(guān)鍵。