梁 玲 江潔蓓 張騰駒 呂佳瑤 陳小紅,2*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，成都 611130；2.長(zhǎng)江上游生態(tài)安全協(xié)同創(chuàng)新中心，成都 611130)

植物器官的顏色受遺傳因素和外部環(huán)境共同影響，由生理生化代謝水平調(diào)控，通過(guò)改變各種色素的種類、含量以及分布形成了豐富的色彩[1]，學(xué)者普遍認(rèn)為花色苷是影響植物花色和葉色呈現(xiàn)的關(guān)鍵因素[2～3]。糖作為花色苷合成的前體和信號(hào)物質(zhì)，可溶性蛋白和脯氨酸作為植物體內(nèi)重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，苯丙氨酸解氨酶(PAL)和查爾酮異構(gòu)酶(CHI)是花色苷合成的相關(guān)酶，過(guò)氧化物酶(POD)是花色苷降解相關(guān)酶，它們都與花色苷的生物合成和降解密切相關(guān)，決定著植物的色彩表型變化[2,4～5]。目前植物呈色研究多集中在不同生長(zhǎng)階段的花色變化或葉色變化上[6～7]，而對(duì)同一時(shí)期花和葉的色彩變化規(guī)律的一致性研究甚少。研究花和葉的呈色生理特性，對(duì)于研究花和葉的進(jìn)化關(guān)系、植物色彩品種改良和提高植物觀賞特性有著重要意義。

珙桐(DavidiainvolucrataBaill.)為珙桐科(Nyssaceae)珙桐屬(Davidia)落葉喬木，屬國(guó)家I級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物[8]，具有很高的學(xué)術(shù)地位和科研價(jià)值。珙桐因其棕紫色頭狀花序外的一對(duì)由葉片進(jìn)化而來(lái)的白色心形大苞片而被稱為“鴿子樹(shù)”，其苞片承擔(dān)著吸引昆蟲(chóng)傳粉的作用，同時(shí)能保護(hù)花序中的花粉，使之不會(huì)遇水失活，在呈色上與葉片有一定的同源性[9]。2016年4月，在四川省珙縣王家鎮(zhèn)珙桐林區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)18株苞片為粉紅色、葉片呈猩紅色的野生珙桐。該“粉紅珙桐”為世界首次發(fā)現(xiàn)，研究?jī)r(jià)值極高，可為珙桐園林觀賞品種的選育提供重要材料。本研究選取同一生境下的粉紅珙桐和普通珙桐植株為試材，探尋影響珙桐苞片和葉片色彩轉(zhuǎn)粉紅的生理因素，以期為珙桐的園林應(yīng)用、品種選育和栽培管理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料采集與預(yù)處理

本試驗(yàn)選取苞片、葉片均呈粉紅色的珙桐植株(粉紅珙桐)為試材，苞片呈白色、葉片呈綠色的珙桐植株(普通珙桐)為對(duì)照，其苞片和葉片的著色情況見(jiàn)圖1。兩種珙桐來(lái)源于四川省宜賓市珙縣王家鎮(zhèn)四里坡原始林區(qū)的同一野生珙桐群落，地理位置為27°54′20.351″N，104°50′24.287″E，海拔1 505 m，現(xiàn)有普通珙桐上千株，混生有粉紅珙桐18株。該區(qū)屬于亞熱帶濕潤(rùn)性季風(fēng)氣候，年平均氣溫18.2℃，年平均降水量1 143.6 mm；土壤類型為黃棕壤，pH5.0～6.7，土壤厚度40～50 cm。珙桐為該群落的喬木層優(yōu)勢(shì)樹(shù)種，伴生有燈臺(tái)樹(shù)(Bothrocaryumcontroversum(Hemsl.) Pojark.)、樟(Cinnamomumcamphora(L.) Presl.)、杉木(Cunninghamialanceolata(Lamb.) Hook.)、野桐(Mallotusjaponicus(Thunb.) Muell. Arg. var.floccosusS.M.Hwang)等少量喬木樹(shù)種，林分郁閉度為0.6。林下主要有川莓(RubussetchuenensisBureau et Franch.)、烏泡子(RubusparkeriHance)、筇竹(QiongzhueatumidinodaHsueh et Yi)、西南繡球(HydrangeadavidiiFranch.)及一些禾草等植物。

于2017年4月25日和2018年4月28日兩次取樣，當(dāng)日上午9:00時(shí)在該珙桐林區(qū)的同一生境內(nèi)(坡向、坡位一致)隨機(jī)選取長(zhǎng)勢(shì)良好、一致的粉紅和普通珙桐植株各6株(樹(shù)齡約30年)，即6次重復(fù)。在東、西、南、北、中五個(gè)方位采集樹(shù)冠外圍中部的當(dāng)年生枝條上處于苞片Ⅳ期[10]的苞片、頂部第2～4片葉，洗凈擦干后，用液氮速凍，置于-80℃條件保存。

1.2 生理指標(biāo)的測(cè)定

類黃酮(FC)、花色苷(AC)、葉綠素(Chl)、類胡蘿卜素(Car)、可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)、脯氨酸含量(Pro)、過(guò)氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定參照李合生[11]的方法；苯丙氨酸解氨酶(PAL)和查爾酮異構(gòu)酶(CHI)活性的測(cè)定參照Lister[12]的方法。所有指標(biāo)的測(cè)定均為3次重復(fù)，取平均值。試驗(yàn)所得的各呈色參數(shù)為兩次取樣的平均值。

圖1 兩種珙桐苞片和葉片的色彩對(duì)比 A.粉紅珙桐苞片；B.普通珙桐苞片；C.粉紅珙桐葉片；D.普通珙桐葉片F(xiàn)ig.1 Comparison of the color of two D.involucrata bracts and leaves A.The bract of pink D.involucrata; B.The bract of common D.involucrata; C.The leaf of pink D.involucrata; D.The leaf of common D.involucrata

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用軟件Excel 2010和SPSS 20.0，對(duì)兩種珙桐的各項(xiàng)生理指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較，各指標(biāo)間采用Spearman系數(shù)進(jìn)行雙變量相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色素含量的比較

色素是植物呈色的物質(zhì)基礎(chǔ)，由圖2可以看出：兩種珙桐苞片的類黃酮含量無(wú)明顯差異(P>0.05)，但在葉片上表現(xiàn)出極顯著差異(P<0.01)，粉紅珙桐葉片類黃酮含量高達(dá)859.53 U·g-1，是普通珙桐的1.52倍，表明類黃酮雖對(duì)珙桐花色變化影響不大，但有助于葉片紅色的形成[2,13]。兩種珙桐的苞片與葉片的花色苷含量都表現(xiàn)出極顯著差異(P<0.01)，粉紅珙桐苞片和葉片的花色苷含量分別是普通珙桐的1.68和3.67倍，說(shuō)明花色苷含量的增加是影響珙桐色彩轉(zhuǎn)紅的關(guān)鍵因素。粉色葉片的葉綠素、類胡蘿卜素含量均略低于綠色葉片，但差異不顯著(P>0.05)，表明光合色素對(duì)珙桐葉片轉(zhuǎn)紅無(wú)直接影響。

圖2 兩種珙桐色素含量的比較 不同小寫(xiě)字母表示在P<0.05水平上差異顯著，不同大寫(xiě)字母表示在P<0.01水平上差異極顯著，下同。Fig.2 Comparison of the pigment content of two D.involucrata Different lowercase letters indicate significant differences at the P<0.05 level,and different capital letters indicate significant differences at the P<0.01 level between different treatments,the same as below.

圖3 兩種珙桐基礎(chǔ)代謝物含量的比較Fig.3 Comparison of the basal metabolite content of two D.involucrata

不同器官的色素含量有差異，珙桐葉片的色素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于苞片(P<0.01)，粉紅珙桐葉片的類黃酮、花色苷含量分別是其苞片的5.55、17.25倍，普通珙桐葉片的類黃酮、花色苷含量分別是其苞片的4.25、7.92倍。可見(jiàn)葉色形成所需要的色素含量更高，可能是因?yàn)槿~片可進(jìn)行光合作用提供更多的底物和能量以供色素的合成代謝。

2.2 基礎(chǔ)代謝物含量的比較

糖作為花色苷的前體物質(zhì)，對(duì)花色和葉色的形成有著重要影響[4]。與普通珙桐相比(見(jiàn)圖3)，粉紅珙桐苞片和葉片的可溶性糖含量分別增加了23.1%和44.4%，說(shuō)明可溶性糖利于花色苷的合成，對(duì)珙桐色彩變紅起著顯著調(diào)節(jié)作用[14]?？扇苄缘鞍资侵参矬w內(nèi)重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，參與大多數(shù)生命活動(dòng)，影響著花色苷的合成[15]。隨苞片和葉片色彩轉(zhuǎn)紅，可溶性蛋白含量分別下降了39.4%和31.3%，在一定程度上抑制了紅色的呈現(xiàn)。脯氨酸是植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，粉紅珙桐苞片和葉片的脯氨酸含量分別是普通珙桐的1.43和1.71倍，可見(jiàn)脯氨酸含量與珙桐的色彩變化有著密切關(guān)系。

這3種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在苞片和葉片中的含量也表現(xiàn)出極顯著差異(P<0.01)，苞片的可溶性糖含量低于葉片，但可溶性蛋白與脯氨酸含量更高，說(shuō)明植物不同器官的代謝水平有一定的差異，合成色素所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量也有所差異。

2.3 酶活性的比較

與普通珙桐相比(見(jiàn)圖4)，隨珙桐色彩轉(zhuǎn)紅，PAL、CHI活性極顯著升高(P<0.01)，粉紅珙桐苞片和葉片的PAL活性分別為普通珙桐的1.51和1.22倍，CHI活性分別為普通珙桐的1.58和2.77倍。而粉紅珙桐與普通珙桐的POD、SOD活性均無(wú)顯著差異(P>0.05)，對(duì)珙桐色彩變化影響并不大。

圖4 兩種珙桐酶活性的比較Fig.4 Comparison of the enzyme activity of two D.involucrata

PAL在苞片和葉片中的活性差異不顯著(P>0.05)，但CHI活性表現(xiàn)出極顯著差異(P<0.01)，苞片的CHI活性更高。珙桐苞片的POD、SOD活性遠(yuǎn)高于葉片(P<0.01)，表明植物不同器官的抗氧化酶系統(tǒng)有差異，苞片具更強(qiáng)的抗氧化能力，以保證花色素的正常合成代謝[16]。

2.4 各生理指標(biāo)間的相關(guān)性分析

色素是引起色彩變化的主要原因，但從表1～2看出，苞片的類黃酮含量與所有指標(biāo)均不存在相關(guān)性，而葉片的類黃酮含量與大多指標(biāo)都存在相關(guān)性；苞片與葉片的花色苷含量都表現(xiàn)為與可溶性糖、脯氨酸含量、PAL、CHI活性呈顯著正相關(guān)，與可溶性蛋白含量呈顯著負(fù)相關(guān)；葉片的光合色素間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，但與其他指標(biāo)不存在相關(guān)關(guān)系?？梢?jiàn)，類黃酮可在一定程度上影響珙桐葉色的呈現(xiàn)，而對(duì)苞片著色影響不大；花色苷在類黃酮中雖僅占0.2%左右，卻對(duì)珙桐花色和葉色的形成都起到?jīng)Q定性作用；光合色素對(duì)葉色變化無(wú)顯著影響。

基礎(chǔ)代謝物影響著植物器官的色彩呈現(xiàn)，可溶性糖與脯氨酸含量間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，且兩者都與類黃酮、花色苷含量、PAL、CHI活性等呈顯著正相關(guān)，而可溶性蛋白含量與這些指標(biāo)呈顯著負(fù)相關(guān)，表明可溶性糖和脯氨酸的積累、可溶性蛋白含量的減少利于類黃酮、花色苷的合成。

酶活性方面，PAL與CHI活性之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，且兩者都與類黃酮、花色苷含量等呈正相關(guān)。苞片的POD活性及SOD活性與所有指標(biāo)均不存在相關(guān)性，但葉片的POD活性與類黃酮含量、PAL活性呈顯著負(fù)相關(guān)?？梢?jiàn)，PAL、CHI促進(jìn)類黃酮、花色苷的合成；POD對(duì)苞片著色無(wú)顯著影響，但可調(diào)節(jié)葉片類黃酮的降解速率[17]；SOD對(duì)苞片和葉片呈色的影響都不大。

3 討論

植物的呈色是多種因素協(xié)同作用的結(jié)果，但根本上是由于特定色素在植物細(xì)胞中的存在[18～19]。類黃酮在植物體中以黃酮苷或黃酮苷元的形式存在，苷元的糖基化對(duì)植物花色及葉色有不同程度的影響[20]。其中花色苷是一類主要的類黃酮色素，廣泛存在于植物細(xì)胞的液泡中,是植物花瓣、葉片的重要呈色物質(zhì)[15]。有研究表明，類黃酮決定著白色系非洲菊(GerberajamesoniiBolus)的花色[21]，影響著金銀花(LonicerajaponicaThunb.)由白到黃的轉(zhuǎn)變[22]，但在月季花(RosachinensisJacq.)[23]、鴛鴦茉莉(BrunfelsiaacuminataBenth.)[2]的研究中認(rèn)為類黃酮對(duì)花色變化無(wú)明顯影響。本研究中，兩種色彩珙桐苞片的類黃酮含量都較低，無(wú)顯著差異，不是珙桐苞片色彩轉(zhuǎn)粉紅的決定性色素。兩種珙桐葉片的類黃酮含量具有顯著性差異，隨珙桐葉色轉(zhuǎn)紅，類黃酮含量呈上升趨勢(shì)，與北美紅楓(AcerrubrumL.)[24]、香山黃櫨(CotinuscoggygriaScop.)[13]秋季葉色變紅表現(xiàn)出一致規(guī)律，表明類黃酮可促進(jìn)葉片紅色的形成，起到輔助呈色的作用[13]?；ㄉ赵陬慄S酮中含量雖極少，僅占0.2%左右，卻是植物色彩變化的決定性代謝產(chǎn)物[2]，其含量增加可顯著促進(jìn)花朵紅色加深[14]。秋季葉色變紅也是由于花色苷大量合成，往往還伴隨著葉綠素的下降，可為花色苷顯色創(chuàng)造條件[25～26]。本研究中，粉紅珙桐苞片和葉片的花色苷含量均極顯著高于普通珙桐，但光合色素并無(wú)顯著差異，表明花色苷是影響珙桐花色及葉色形成的關(guān)鍵因素，其含量的增加使珙桐的色調(diào)轉(zhuǎn)紅，而光合色素對(duì)其影響不大。

表1 珙桐苞片各指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)

注：*和**分別表示在0.05和0.01水平上相關(guān)性顯著，下同。

Note:*indicates significant correlation at the 0.05 level,**indicates significant correlation at the 0.01 level,the same al below.

表2 珙桐葉片各指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)

注：Chl a.葉綠素a含量；Chl b.葉綠素b含量；Chl.總?cè)~綠素含量；Car.類胡蘿卜素含量

Note:Chl a.Chlorophyll a content; Chl b.Chlorophyll b content; Chl.Chlorophyll content; Car.Carotenoid content

糖是花色苷合成的必需底物，作為能源物質(zhì)維持植物的正常發(fā)育，也可通過(guò)特異的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)花色苷合成酶基因的表達(dá)，其含量與花色苷合成密切相關(guān)[4]。本研究中，粉紅珙桐的可溶性糖含量顯著高于普通珙桐，且與花色苷含量呈顯著正相關(guān)，表明可溶性糖的增加促進(jìn)花色苷的積累，與前人[6,14,27]研究結(jié)果一致。植物體內(nèi)莽草酸代謝是蛋白質(zhì)和花色苷合成的共同途徑，苯丙氨酸階段是兩個(gè)途徑的分支點(diǎn)，隨植物體內(nèi)外環(huán)境的改變，此階段適合蛋白質(zhì)合成的條件不利于花色苷的生成，從而使蛋白質(zhì)與花色苷含量之間的相關(guān)性處于不斷變化之中[28]。賀窯青[14]發(fā)現(xiàn)紅花玉蘭(MagnoliawufengensisL.Y.Ma et L.R.Wang)的可溶性蛋白與花色苷含量呈顯著負(fù)相關(guān)。聶慶娟[15]在紅櫨(Cotinuscoggygria‘Royal Purple’)葉片的研究上發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關(guān)，而孟祥春[28]對(duì)矮牽牛(PetuniahybridaVilm.)的研究顯示兩者之間沒(méi)有顯著規(guī)律，不同色彩的植物表現(xiàn)出很大的差異性。在珙桐色彩轉(zhuǎn)紅的過(guò)程中，可溶性蛋白含量顯著下降，在一定程度上抑制了花色苷的合成。脯氨酸是植物蛋白質(zhì)的組分之一，具有穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)部pH、解除氨毒，作為能量庫(kù)調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原勢(shì)，穩(wěn)定膜的結(jié)構(gòu)和保護(hù)酶，清除活性氧等功能，以保持穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境供花色苷合成代謝[29～31]。本研究中，脯氨酸含量隨珙桐色彩轉(zhuǎn)紅而顯著升高，且與花色苷含量呈顯著正相關(guān)，表明脯氨酸可清除活性氧以保證花色苷的正常代謝，利于珙桐紅色的呈現(xiàn)[29,32]。

花色苷是在一系列酶的催化下形成的次生代謝產(chǎn)物，其中PAL是苯丙烷類代謝途徑中的第一個(gè)酶，CHI是催化花色苷前體黃烷酮合成的酶，兩者都在花色苷合成代謝中起著重要作用[14]。但PAL和CHI與花色苷合成的關(guān)系一直存在爭(zhēng)議，李玲[5]、張超[6]認(rèn)為PAL、CHI顯著影響著花色苷的代謝，但王慧聰[33]、Lister[34]等人則認(rèn)為PAL、CHI與花色苷的積累并無(wú)密切關(guān)系。本研究通過(guò)對(duì)兩種珙桐的PAL和CHI活性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，隨珙桐色彩轉(zhuǎn)紅，PAL、CHI活性顯著升高，與花色苷含量呈正相關(guān)，且PAL活性還與可溶性蛋白含量呈負(fù)相關(guān)。說(shuō)明PAL能阻止戊糖代謝中形成的苯丙酮酸不與氨結(jié)合生成苯丙氨酸向形成可溶性蛋白方向發(fā)展，而是朝著合成花色素的方向進(jìn)行[35]，與CHI作為花色苷合成的關(guān)鍵酶，共同調(diào)控著花色和葉色的形成，酶活性越高，色彩越偏向紅色。

POD和SOD是植物體內(nèi)清除自由基的主要保護(hù)酶，其活性對(duì)植物色彩變化有著重要影響[2]。POD活性可影響葉片的多酚含量，有利于葉片呈現(xiàn)紅色[15,36]，但卓啟苗[7]認(rèn)為POD對(duì)葉色變化影響不大，陳小紅[2]認(rèn)為POD影響著花瓣中花色苷的降解速率。曹盼盼[37]研究發(fā)現(xiàn)花色苷可通過(guò)激活酶活性來(lái)達(dá)到抗氧化的作用，對(duì)SOD活性有明顯促進(jìn)作用。而本研究中，兩種珙桐的POD、SOD活性均無(wú)顯著差異，葉片的POD活性與類黃酮含量、PAL活性呈顯著負(fù)相關(guān)。表明POD可能影響了葉片中類黃酮物質(zhì)的降解[17]，但POD和SOD均不是影響珙桐色彩轉(zhuǎn)紅的主要因素，與在歐洲衛(wèi)矛(Euonymuseuropeaus)[7]、北美紅楓(AcerrubrumL.)[24]上的研究結(jié)果一致。

苞片是花序內(nèi)不能促進(jìn)植物生長(zhǎng)的變態(tài)葉狀物，由葉進(jìn)化而來(lái)，兩者在色彩呈現(xiàn)上具有一定的同源性[38]。珙桐苞片和葉片的色彩變化都主要由花色苷決定，類黃酮雖對(duì)花色影響不大，但可增加葉色的艷麗程度，起到輔助呈色的作用[13]。珙桐葉片的色素、可溶性糖含量遠(yuǎn)高于苞片，說(shuō)明葉片合成色素的能力更強(qiáng)，可能是由于葉片可進(jìn)行光合作用提供更多的糖類和能量以供色素的合成代謝。珙桐苞片的可溶性蛋白、脯氨酸含量、POD、SOD、CHI活性均高于葉片，可溶性蛋白、脯氨酸在滲透調(diào)節(jié)中起著重要作用，POD和SOD是植物體內(nèi)重要的保護(hù)酶，可見(jiàn)苞片為了保證花色素的正常合成代謝，形成了相應(yīng)的保護(hù)機(jī)制。

綜上所述，花色苷是珙桐苞片色彩轉(zhuǎn)粉紅的直接因素，而葉片呈現(xiàn)紅色是類黃酮和花色苷共同作用的結(jié)果，可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、PAL、CHI通過(guò)一定生理代謝調(diào)節(jié)花色苷的形成，進(jìn)而影響珙桐苞片和葉片的著色。植物呈色由遺傳因素和外界環(huán)境共同決定[1]，而本研究試驗(yàn)材料均取自同一生境，立地及管理?xiàng)l件一致，可排除外界條件的影響，今后需要在細(xì)胞及分子遺傳等方面對(duì)珙桐色彩變化機(jī)制進(jìn)行深入研究。