寧遠蘭， 沈 文， 敖 芬

(陜西科技大學 食品與生物工程學院, 陜西 西安 710021)

0 引言

槲皮素(Quercetin，QT)，又稱槲皮黃素，是一種天然黃酮類化合物[1]，具有祛痰止咳、抗氧化、抗腫瘤、清除自由基等藥理作用[2,3]，研究發(fā)現(xiàn)槲皮素在糖尿病的治療研究中有明顯效果[4].但是，槲皮素的低溶解度(0.17 ～ 7.7μg/ mL)限制了其生物膜透過性，吸收困難，在醫(yī)藥領域的應用受到了限制[5]，主要是因其在體循環(huán)中以共軛形式存在[6].藥代動力學實驗表明[7]，大鼠灌胃給予槲皮素50 mg/kg后的最大血漿濃度Cmax為(2.033±0.410)μg/mL，相較同類藥物生物利用度較低.因此需要一種能夠提高槲皮素溶解度的高效載體來提高其生物利用度.通過將載體的尺寸減少到微米至納米級別，如制備成納米顆粒、聚合物膠束、微乳、水凝膠，能夠明顯增大這種藥物的溶解度[8-13].

相比于上述納米載體，納米乳(Nanoemulsion)在研究和藥物治療中引起了極大的關注.納米乳液呈現(xiàn)透明或半透明狀態(tài)，相對其他液體制劑具有顯著的優(yōu)勢[14]：粒徑小且均勻，提高藥物的分散度；可輕易穿過細胞間隙，明顯提高細胞對藥物的攝取率，從而增強藥物的靶向性及高效性.按其結(jié)構(gòu)類型劃分為O/W型、W/O型和雙連續(xù)相型三種[15]，作為載體，生物相容性很好，可以減少藥物對人體的刺激性和毒副作用[16].有研究[17]制備了粒徑為106 nm的槲皮素納米乳，載藥量為0.05%，并將其應用于肺癌的治療，顯示出藥物傳遞的有效性.

因此，本研究通過滴濁法，用Origin8.5軟件繪制偽三元相圖，篩選出合適的油相、表面活性劑和助表面活性劑，按照一定比例混合均勻，形成O/W型納米乳.通過染色法確定了納米乳結(jié)構(gòu)，通過電導率、粘度數(shù)據(jù)說明了其均勻性，通過加速穩(wěn)定性試驗、Zeta電位研究了納米乳的穩(wěn)定性，通過激光粒度表征了納米乳的乳滴粒徑及分布，通過透射電鏡表征了其微觀形態(tài)，分析了影響納米乳體系穩(wěn)定性的因素.通過HPLC標準曲線法，考察了穩(wěn)定納米乳對難溶性藥物槲皮素的增溶作用，載藥量為0.15%，起到了明顯的增溶作用.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

槲皮素對照品(批號100081-200406)，購自中國藥品生物制品檢定所；肉豆蔻酸異丙酯(IPM)，購自上海源葉生物科技有限公司；二甲基硅油，購自天津永晟精細化工有限公司；聚氧乙烯40氫化蓖麻油(RH40)，購自巴斯夫股份公司(中國)；乳化劑OP-10、丙三醇，購自天津市富宇精細化工有限公司；試劑純度均為分析純；高效液相色譜試劑均為色譜純；其余試劑均為常規(guī)市售試劑.

1.2 儀器與設備

98-II-B型磁力攪拌電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)；NDJ-9S型數(shù)顯粘度計(上海精密科學儀器有限公司)；Zetasizer NANO-ZS90型納米粒度分析儀(美國康塔儀器公司)；DDSJ-308A型電導率儀(上海儀電科學儀器股份有限公司)；Tecnai G2 F20型透射電子顯微鏡(美國FEI公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司).

1.3 空白納米乳組分的篩選

1.3.1 油相的選擇

油相應選擇對藥物溶解度大的無毒無刺激的短鏈油相，因此待選油相有IPM、乙酸乙酯、二甲基硅油、液體石蠟.根據(jù)各油相與表面活性劑、助表面活性劑形成體系外觀，選擇合適的油相.

1.3.2 表面活性劑的選擇

表面活性劑可根據(jù)親水親油平衡值(HLB值)篩選，一般HLB值為3 ～ 8的乳化劑可制備W/O型納米乳，HLB值為8 ～ 16的乳化劑可制備O/W型納米乳.本研究待選表面活性劑有吐溫80(HLB=15)、聚氧乙烯40蓖麻油(RH40)(HLB=14 ～ 16)和乳化劑OP-10(HLB=14.5).

將三種表面活性劑與合適的油相，分別按照9∶1～1∶9(質(zhì)量比)混合均勻，緩慢滴加純凈水，觀察體系的澄清度，準確記錄相變時水的用量.分別以水相、表面活性劑/助表面活性劑、油相為頂點繪制偽三元相圖，根據(jù)相圖中成乳區(qū)域面積的大小確定表面活性劑的種類.

1.3.3 助表面活性劑的選擇

助表面活性劑在納米乳的形成過程中可以協(xié)調(diào)降低水相、油相的表面張力，增加表面活性劑的溶解度，一般為中鏈、短鏈醇.本研究以丙三醇、1,2-丙二醇、無水乙醇作為助表面活性劑，將助表面活性劑與表面活性劑混合均勻；按照不同的質(zhì)量比，加入到油相中，用純水滴濁，記錄相變時水的體積，繪制偽三元相圖，根據(jù)成乳區(qū)域面積的大小確定助表面活性劑.

1.3.4 表面活性劑和助表面活性劑質(zhì)量比(Km)的確定

將篩選出的表面活性劑和助表面活性劑與油相以1∶9～9∶1的比例混合，根據(jù)偽三元相圖中成乳區(qū)域面積的大小、乳化顆粒在乳液中的性質(zhì)、乳化程度及體系穩(wěn)定性，來確定最佳Km值.

1.4 槲皮素納米乳的制備

將篩選出的油相、表面活性劑、助表面活性劑和水按照一定比例混合均勻，制備槲皮素納米乳.

1.5 槲皮素納米乳的表征

1.5.1 納米乳結(jié)構(gòu)類型及電導率、穩(wěn)定性表征

采用染色法進行結(jié)構(gòu)類型鑒別.所用蘇丹紅III是油溶性染料，在油相中易擴散；亞甲基藍是水溶性染料，易在水相擴散.根據(jù)此性質(zhì)，如納米乳中蘇丹紅III染料的擴散速度大于亞甲基藍染料，則為W/O型納米乳；反之，則為O/W型納米乳.取適量試樣，進行電導率、粘度平行組測試，并分別在-3 ℃～0 ℃低溫冷凍2 h與12 000 r/min高速離心30 min條件下進行穩(wěn)定性測試.

1.5.2 形態(tài)表征

透射電子顯微鏡觀察納米乳的微觀形態(tài).將適量槲皮素納米乳稀釋10倍后在磁力攪拌器上混勻，使其分散完全.用移液槍吸取20μL待測樣品滴加在覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上，重復操作三次.將處理完成的銅網(wǎng)放在質(zhì)量分數(shù)為2.0 %磷鎢酸中負染10 min取出，室溫揮干，然后用透射電鏡觀察其形態(tài).

1.5.3 粒徑和Zeta電位

采用納米粒度分析儀測定平均粒徑及Zeta電位；取適量槲皮素納米乳，稀釋10倍后，用納米粒度分析儀測定平均粒徑及Zeta電位，記錄平均粒徑、多分散指數(shù)(PDI)、Zeta電位及其分布圖.

1.5.4 納米乳對槲皮素增溶能力的測試

室溫條件下，將槲皮素分別溶于純凈水和空白納米乳中，采用高效液相色譜法(HPLC)測定，以槲皮素對照品溶液濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，制作標準曲線，測定含量.

2 結(jié)果與討論

2.1 空白納米乳組分的篩選

2.1.1 油相的選擇

三種油相形成的混合體系外觀如圖1所示.當油相為液體石蠟、二甲基硅油時，整個混合體系十分不穩(wěn)定，放置10 min即出現(xiàn)分層現(xiàn)象.隨著水量的增加，體系流動性逐漸增大，顏色為乳白色；油相為IPM時，混合體系呈現(xiàn)透明狀態(tài)，但是有游離油滴存在，放置1 h后同樣出現(xiàn)分層現(xiàn)象；油相為乙酸乙酯時，混合體系呈完全透明狀態(tài)，符合納米乳外觀評定標準，本研究方案選用乙酸乙酯作為油相.

a:乙酸乙酯；b:IPM；c:液體石蠟；d:二甲基硅油圖1 不同油相形成納米乳的外觀

2.1.2 表面活性劑的選擇

表面活性劑能夠顯著降低界面張力形成界面膜保持納米乳的穩(wěn)定性，其選擇需考慮安全經(jīng)濟等問題[18]，偽三元相圖法中成乳區(qū)域的面積越大，表明乳化效果越好，形成的納米乳就越穩(wěn)定[19].由預實驗可知乙酸乙酯與吐溫80、RH40和乳化劑OP-10在一定比例范圍內(nèi)均可形成澄清透明的納米乳.如圖2所示，在三種表面活性劑繪制的偽三元相圖中，乳化劑OP-10形成納米乳區(qū)域的面積最大，這是由于乳化劑OP-10的加入使得混合體系中油相和水相之間的界面張力得到平衡，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性.因此，選用乳化劑OP-10作為表面活性劑.

(a)乳化劑OP-10 (b)RH40

(c)吐溫80圖2 不同表面活性劑對納米乳成乳區(qū)域面積的影響

2.1.3 助表面活性劑的選擇

選擇丙三醇、1,2-丙二醇、無水乙醇作為助表面活性劑.在室溫條件下，將乙酸乙酯、三種助表面活性劑與乳化劑OP-10按照不同的質(zhì)量比混合均勻，滴加純凈水，記錄體系相變時所需水量.同法繪制偽三元相圖，根據(jù)成乳區(qū)域面積的大小確定助表面活性劑的種類.由圖3得知，助表面活性劑為1,2-丙二醇時，形成的納米乳區(qū)域面積明顯小于丙三醇和無水乙醇，丙三醇和無水乙醇成乳面積大小肉眼觀察差別不大，因此利用曲線擬合計算面積，發(fā)現(xiàn)丙三醇作為助表面活性劑成乳區(qū)域面積大于無水乙醇作為助表面活性劑的面積.但是由于丙三醇的粘度遠高于無水乙醇，不易調(diào)節(jié)納米乳體系中油相、水相的相互作用力.此外，無水乙醇具有較強的剪切力[20]，使得體系中的油相分子被切割成直徑更小的粒子，油相在水中的分散度增加，納米乳更加穩(wěn)定.且槲皮素在無水乙醇中的溶解度要遠高于丙三醇，因此，選用無水乙醇作為助表面活性劑.

(a)1,2-丙二醇 (b)丙三醇

(c)無水乙醇圖3 不同助表面活性劑對納米乳成乳區(qū)域面積的影響

2.1.4 表面活性劑和助表面活性劑質(zhì)量比(Km)的確定

根據(jù)上述篩選實驗的結(jié)果，選擇乙酸乙酯為油相，乳化劑OP-10為表面活性劑，無水乙醇為助表面活性劑，設定兩者質(zhì)量比(Km)為1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1，結(jié)果如圖4所示，當Km為1∶2、1∶1、3∶1、4∶1時成乳區(qū)域面積較小；當乳化劑OP-10與無水乙醇的質(zhì)量為2∶1時，混合乳化劑的HLB值與油相最接近，偽三元相圖乳化區(qū)域面積最大，隨著表面活性劑用量的增加，納米乳更易形成，且粒徑更小，體系也更加穩(wěn)定，因此確定Km為2∶1.

由2.1.1～2.1.4確定空白納米乳的組成為：乙酸乙酯/乳化劑OP-10/無水乙醇/純凈水，混合體系中混合表面活性劑與油相質(zhì)量比為6∶4，Km為2∶1.

精密稱取0.6 g乳化劑OP-10與0.3 g無水乙醇均勻攪拌，加入0.6 g乙酸乙酯和0.01 g槲皮素，繼續(xù)攪拌并滴加純凈水，形成澄清穩(wěn)定乳液，蒸餾水用量為5.05 mL.制備得到槲皮素納米乳.

(a)Km：1∶2 (b)Km：1∶1

(c)Km：2∶1 (d)Km：3∶1

(e)Km：4∶1圖4 不同Km值對納米乳成乳區(qū)域面積的影響

2.2 槲皮素納米乳的表征

2.2.1 外觀及結(jié)構(gòu)類型鑒定

本研究制備的槲皮素納米乳呈現(xiàn)淺黃色、均一澄清透明狀態(tài)，激光照射下出現(xiàn)丁達爾效應.結(jié)構(gòu)類型鑒別結(jié)果顯示，納米乳中亞甲基藍染料的擴散速度大于蘇丹紅III染料，表明本研究制備的槲皮素納米乳為O/W型.

2.2.2 電導率、粘度及穩(wěn)定性測定

用電導率儀測定槲皮素納米乳電導率，在同一樣品中平行測量三次.結(jié)果顯示平均電導率為99.0μs/cm，結(jié)果如表1所示.

表1 槲皮素納米乳的電導率

電導率結(jié)果顯示槲皮素納米乳具有均一穩(wěn)定的電化學特征，導電能力強，說明其結(jié)構(gòu)具有等量的內(nèi)極化能力.取槲皮素納米乳適量，用數(shù)顯粘度計測定其粘度，平行測量三次.結(jié)果顯示平均粘度為0.024 Pa·s，結(jié)果如表2所示.

表2 槲皮素納米乳的粘度

粘度測試結(jié)果表明，所制備的槲皮素納米乳屬于典型的牛頓流體，其流體內(nèi)部質(zhì)點符合牛頓運動定律，分子熱運動定律.電導率與粘度檢測結(jié)果說明本研究所制備的槲皮素納米乳具有均一穩(wěn)定的特質(zhì).

離心穩(wěn)定性試驗和冷凍試驗的結(jié)果如圖5所示，均表現(xiàn)出穩(wěn)定狀態(tài)，結(jié)果表明，本研究制備的槲皮素納米乳宏觀穩(wěn)定性良好.

a、c為對照；b為冷凍后狀態(tài)；d為離心后狀態(tài)圖5 槲皮素納米乳穩(wěn)定性

2.2.3 微觀形態(tài)

納米乳的微觀形態(tài)采用場發(fā)射透射電子顯微鏡進行觀察，圖6為槲皮素納米乳在透射電鏡下的觀察結(jié)果.表征結(jié)果顯示，乳滴之間分散較為均勻，外形規(guī)則，呈現(xiàn)完整的球形且界面邊緣清晰.但是乳滴粒徑的均勻度不十分理想，與粒度分析儀結(jié)果有出入，針對此現(xiàn)象進行分析，可能是因為在表征過程中透射電鏡發(fā)出的加速電子束照射在納米乳滴表面，造成部分乳滴破乳，從而使其融合聚集使得粒徑增大.

圖6 槲皮素納米乳透射電鏡圖

2.2.4 粒徑分布及Zeta電位測定

粒徑能夠判別納米乳是否成形，同時也是評價納米乳穩(wěn)定的重要性質(zhì).經(jīng)納米粒度分析儀測定的槲皮素納米乳粒徑分布如圖7所示，平均粒徑為14.43±0.25 nm，多分散指數(shù)(PDI)為0.157，集中分布在6 ～ 29 nm之間.在混合體系中，粒子的分布數(shù)量為一條左右較對稱的圓滑曲線，顯示了正偏態(tài)分布特征，說明槲皮素納米乳的粒徑分布范圍集中，粒徑大小較均勻，符合納米乳的基本要求.

圖7 槲皮素納米乳粒徑分布圖

Zeta電位是用來衡量粒子間相互排斥或吸引作用強度的，Zeta電位的絕對值越大，粒子的抗凝聚作用越強，整個系統(tǒng)就越穩(wěn)定.反之，Zeta電位的絕對值越小，粒子的凝聚作用越強，穩(wěn)定性就會越弱.如圖8所示，室溫條件下，測得Zeta電位為1.25 ± 0.45 mV，具有較好的界面滑動能力，乳化體系的穩(wěn)定性較強.

圖8 槲皮素納米乳Zeta電位分布圖

2.2.5 納米乳對槲皮素增溶程度的表征

(1)色譜條件的確定

色譜柱：C18(10μm，250 × 4.6 mm)；流動相：甲醇-0.4 %磷酸水溶液(50∶50，V/V)；檢測波長：360 nm；體積流量：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10μL.

(2)標準曲線的建立

精密稱取干燥至恒重的槲皮素對照品20 mg，置25 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得800μg/mL對照品母液，避光放置.精密吸取0.01 mL、0.03 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL、3 mL對照品溶液置5 mL容量瓶中，加甲醇定容并搖勻.分別取各濃度對照品溶液10μL，按上述色譜條件進行測定.以槲皮素對照品溶液濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，進行線性回歸[21]，得到標準曲線的方程為：y=45.579x-10.043，R2=0.998 4，線性關系良好.

測得槲皮素納米乳中槲皮素的含量為354.84μg/ mL，相較于槲皮素在水中的溶解度(0.17 ～ 7.7μg/ mL)，將槲皮素制成納米乳顯著提高了溶解度，如表3所示.也表明將難溶性藥物制備成納米乳是提高其水溶性十分有效的方法.

表3 不同分散介質(zhì)槲皮素的溶解度

(3)槲皮素納米乳在人工胃液、人工腸液中槲皮素的含量測定

人工胃液：取稀鹽酸(取鹽酸234 mL，加水稀釋至1 000 mL，即得)16.4 mL，加水稀釋成1 000 mL即得[22].

人工腸液：取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL使溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至6.8得磷酸二氫鉀溶液，加水稀釋至1 000 mL即得[22].

取上述兩種介質(zhì)各200 mL于燒杯中，各滴加3 mL槲皮素納米乳，在轉(zhuǎn)速為150 r/min的磁力攪拌器上攪拌2 h.按“2.2.5”節(jié)中色譜條件測量槲皮素納米乳在兩種介質(zhì)中的含量.結(jié)果如表4所示，研究制備的槲皮素納米乳在人工胃液和人工腸液中的溶解度遠高于原料藥槲皮素在兩者中的溶解度，分別為323.27μg/mL和352.64μg/mL，表明本研究制備的納米乳能很好地釋放藥物槲皮素.

表4 不同介質(zhì)槲皮素的含量

3 結(jié)論

本研究以乙酸乙酯為油相，選用乳化劑OP-10作為表面活性劑，無水乙醇作為助表活性劑，采用水滴定法制備了槲皮素納米乳，并通過多種方法對納米乳進行表征.制備的槲皮素納米乳外觀為淺黃色、澄清透明、流動性良好，屬于O/W型納米乳；平均粒徑在14 nm左右，多分散指數(shù)(PDI)為0.157，表明粒徑分布均勻.穩(wěn)定性試驗顯示納米乳具有良好的穩(wěn)定性，且制備工藝簡單，容易操作.為驗證納米乳對槲皮素增溶效應，采用HPLC測定槲皮素的含量，結(jié)果顯示，與槲皮素在水中的溶解度(0.17～7.7μg/ mL)相比，槲皮素在納米乳中的溶解度(354.84μg/mL)顯著增加，表明納米乳作為藥物載體能夠很好的增加難溶性藥物的溶解度，從而增大生物利用度，可為槲皮素納米制劑提供一定的理論與數(shù)據(jù)支持.