鐘 斐， 李成濤， 張 敏

(陜西科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

隨著我國(guó)栽培技術(shù)的成熟，農(nóng)用地膜的使用量逐年攀升[1],地膜難降解、回收難等問題日益凸顯，因此可生物降解地膜得到了廣泛研究關(guān)注.可生物降解地膜在田間鋪設(shè)的過程中，隨著植物的生長(zhǎng)發(fā)育，地膜開始發(fā)生降解過程.一方面，自然環(huán)境中的水分可以使地膜進(jìn)行水解過程，另一方面由于土壤中存在多種多樣的微生物，而微生物產(chǎn)生的蛋白酶使地膜可以進(jìn)行酶解過程[2].但是降解產(chǎn)物在土壤環(huán)境中積累到一定程度后，容易被植物根系吸收，進(jìn)而被運(yùn)輸?shù)街参锏牡厣喜糠?，直接影響植物的養(yǎng)分和水分吸收能力，甚至影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[3].

脂肪族聚酯類的地膜如聚己二酸丁二醇酯(PBS)、聚乳酸(PLA)等由于其熱塑性良好、生物降解性優(yōu)異等特點(diǎn)而備受青睞[4].張敏等[5]通過PBS對(duì)植物生理特性的研究發(fā)現(xiàn)，低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PBS對(duì)青菜、生菜的生長(zhǎng)發(fā)育具有促進(jìn)作用.張敏等[6]又通過PBS/PLA共聚物對(duì)青菜生長(zhǎng)發(fā)育的研究發(fā)現(xiàn)，PBS/PLA共聚物能夠提高植物的過氧化物酶活性增強(qiáng)其抗逆性.

聚丁二酸己二酸丁二醇酯(PBSA)是一種生產(chǎn)成本低、力學(xué)性能好、加工性能優(yōu)異，在土壤環(huán)境中可以進(jìn)行自然降解以及微生物降解過程[7]，且降解產(chǎn)物對(duì)環(huán)境無污染的綠色材料[8].Motoo等[9]通過研究從大麥葉片分離得到的B47-9型菌株在土壤環(huán)境中對(duì)PBSA膜的降解發(fā)現(xiàn)，6天內(nèi)降解率可達(dá)91.2%.Katerina等[10]通過研究含有不同濃度PBSA的水體對(duì)虹鱒的毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PBSA能夠進(jìn)入虹鱒體內(nèi)并對(duì)其細(xì)胞色素、血液指標(biāo)及酶活性產(chǎn)生影響.Wang等[11]通過研究PBSA膜在棉花種植過程中的變化發(fā)現(xiàn)，PBSA膜能夠在作物種植過程中有效降解，緩解殘留地膜對(duì)土壤環(huán)境的威害.

但是，國(guó)內(nèi)有關(guān)其作為可生物降解地膜時(shí)對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響少有報(bào)道.因此，本研究通過PBSA的降解產(chǎn)物分析以及植物盆栽實(shí)驗(yàn)，探究了PBSA在其降解過程中對(duì)青菜種子發(fā)芽及生長(zhǎng)周期生理生化指標(biāo)的影響，綜合評(píng)價(jià)了PBSA作為地膜成分時(shí)對(duì)青菜的生態(tài)學(xué)效應(yīng)，并為PBSA作為地膜材料的安全推廣及應(yīng)用提供了理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料及培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)中所用到的PBSA均由實(shí)驗(yàn)室合成.植物種子選用矮抗青，購(gòu)自上海市閔行區(qū)種子公司，實(shí)驗(yàn)前用10%次氯酸鈉進(jìn)行消毒，并用去離子水進(jìn)行沖洗.種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)取樣時(shí)間為7 d，生長(zhǎng)周期實(shí)驗(yàn)取樣時(shí)間為0 d、11 d、27 d、35 d.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PSA膜的制備及其降解實(shí)驗(yàn)

(1)PBSA共聚物的合成

在100 mL的三口燒瓶中加入一定量的1,4-丁二酸、1,4-丁二醇和己二酸單體(其中1,4-丁二酸、1,4-丁二醇的摩爾比為1∶1.05，己二酸單體的量占總醇量的20%)，并加入一定量的鈦酸四丁酯Ti(OBu)4作為催化劑；在氮?dú)猸h(huán)境下油浴加熱使反應(yīng)體系迅速升溫至180 ℃，反應(yīng)至脫水恒定后，逐步升溫至220 ℃，開始抽真空2 h左右至體系變粘稠，反應(yīng)結(jié)束；趁熱將產(chǎn)物從燒瓶?jī)?nèi)刮下，冷卻后將其溶解于一定量的氯仿中，攪拌至充分溶解，將聚酯的氯仿溶液緩慢倒入無水乙醇中，聚酯以白色絮狀物析出，即為PBSA，在40 ℃下真空干燥24 h[12].

(2)薄膜制備及降解實(shí)驗(yàn)

式中,α0表示純氣體在吸收線中心的吸收系數(shù),νg和δν分別為對(duì)應(yīng)吸收線的中心頻率和吸收線半寬。當(dāng)光源輸出中心頻率精確鎖定在甲烷氣體的吸收峰即ν0=νg時(shí),將式(3)代入式(2),可得

采用開煉機(jī)制備共聚物薄膜：稱取一定量的PBSA干燥待用.先將開煉機(jī)空車預(yù)熱一段時(shí)間，同時(shí)進(jìn)行空車加油潤(rùn)滑，將輥?zhàn)由郎刂粱蚪咏鼫囟仍O(shè)定值時(shí)，將制得的PBS基共聚物粉末添加到開煉機(jī)上制成平均厚度約為0.20 mm厚的光滑薄膜，然后裁成1.5 cm×2.5 cm大小的試樣，用蒸餾水清洗，40 ℃真空干燥至恒重備用[13].

1.2.2 共聚物的酶催化降解

首先配制pH為7.0±0.01，濃度為0.05 mol/L的KH2PO4-K2HPO4緩沖溶液，備用.將干燥好的1.5 cm×2.5 cm薄膜試樣放入50 mL的離心管中，然后加入12 mL 脂肪酶活力為6 000 U/L的 KH2PO4-K2HPO4緩沖溶液，密封后置于恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行酶催化降解實(shí)驗(yàn)，設(shè)定轉(zhuǎn)速為120 r/min，溫度為50 ℃.并且每組降解實(shí)驗(yàn)設(shè)置三組平行實(shí)驗(yàn)，以不加脂肪酶的實(shí)驗(yàn)為空白對(duì)照組.定時(shí)取樣，后用蒸餾水洗干凈，并在40 ℃的溫度下真空干燥至恒重，待測(cè).

1.2.3 質(zhì)量損失率計(jì)算

PBSA薄膜降解前后的質(zhì)量變化代表PBSA的質(zhì)量損失率，質(zhì)量損失率(Mass%)按式(1)進(jìn)行計(jì)算.

(1)

式(1)中：m0-降解前薄膜的原始質(zhì)量(g)；mt-降解后薄膜的剩余質(zhì)量(g).

1.2.4 相對(duì)分子質(zhì)量及分布測(cè)試

采用凝膠滲透色譜(GPC)(三氯甲烷為流動(dòng)相，樣品濃度約為3 mg/mL，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，示差折光檢測(cè)器，進(jìn)樣量為20μL，聚苯乙烯為標(biāo)樣)進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)試.

1.2.5 降解產(chǎn)物成分分析

1.2.6 青菜種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)方法

選擇顆粒飽滿的青菜種子；取陜西科技大學(xué)花園土裝于營(yíng)養(yǎng)缽中，每缽100 g土,把PBSA粉末以質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.2%的比例與土壤混勻配制，每種處理樣重復(fù)3組,并設(shè)置空白對(duì)照.每盆播種青菜種子20粒，在光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為恒溫25 ℃、相對(duì)濕度75%，12 h光照/12 h黑暗周期培養(yǎng).每日記錄發(fā)芽數(shù)，培養(yǎng)7 d后，測(cè)定每株的根長(zhǎng)、苗長(zhǎng).

1.2.7 青菜生長(zhǎng)周期實(shí)驗(yàn)方法

將青菜種子播種在營(yíng)養(yǎng)缽中進(jìn)行培養(yǎng)，待長(zhǎng)出3～4片真葉時(shí)記為第一天.取陜西科技大學(xué)花園土裝于營(yíng)養(yǎng)缽中，每缽100 g土,把PBSA粉末以質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.2%的比例與土壤混勻配制，每種處理樣重復(fù)3組,并設(shè)置空白對(duì)照.于不同生長(zhǎng)期(定植后0 d、11 d、27 d、35 d)取樣后，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定葉片中可溶性蛋白質(zhì)的含量[5]、丙酮法測(cè)定葉綠素含量[14]、硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛(MDA)的含量[14]、愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過氧化物酶(POD)含量[14].

2 結(jié)果與討論

2.1 PBSA的質(zhì)量損失率

從圖1可以看出，己二酸和己二醇含量為20%時(shí)，降解5 d后薄膜的降解速率已接近100%，且聚酯的降解呈先快后慢的趨勢(shì)，這是由于降解到后期脂肪酶活性降低，降解速率變慢.改性后的聚酯降解性提高，是由于第三組分的加入，打破了PBSA分子鏈的有序結(jié)構(gòu)，使聚合物主鏈結(jié)構(gòu)更加松散，酶可以更容易進(jìn)攻，從而提高其降解性.整體比較而言，水相體系中，在PC脂肪酶的催化作用下，PBSA的質(zhì)量損失率較快.相比實(shí)驗(yàn)組，幾組空白實(shí)驗(yàn)的降解率基本為零，表明降解過程中基本不存在水解，PBSA的降解都是由脂肪酶對(duì)酯鍵的識(shí)別、進(jìn)攻以及分解所致.

圖1 共聚物質(zhì)量損失率隨降解時(shí)間變化圖

2.2 PBSA降解前后相對(duì)分子質(zhì)量隨降解時(shí)間的變化

圖2為水相體系中，在PC脂肪酶的作用下PBSA的相對(duì)分子質(zhì)量隨降解時(shí)間的變化圖.由圖2可以看出，隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)，聚合物的相對(duì)分子質(zhì)量下降較為明顯，可以說明PBSA發(fā)生了較為明顯的降解，且有低聚物和小分子物質(zhì)生成.

圖2 共聚物PBSA降解過程中Mn的變化圖

2.3 共聚物的降解產(chǎn)物分析

在降解過程中，共聚物PBSA的酯鍵發(fā)生斷裂，長(zhǎng)鏈的高分子逐漸變?yōu)槎替湹牡头肿踊騿误w，故降解產(chǎn)物中可能存在多種成分.為進(jìn)一步分析共聚物PBSA的降解產(chǎn)物成分，對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行了MALDI-TOF-MS測(cè)試，如圖3所示，為PBSA酶催化降解產(chǎn)物的MALDI-TOF-MS譜圖.

圖3 PBSA降解物的MALDI-TOF-MS譜圖

圖3中相對(duì)豐度較高的一系列離子峰為降解產(chǎn)物中低聚物與H+加合而形成的離子峰；共聚物在水相體系中酶催化降解5 d后，均可產(chǎn)生低聚物，但PBSA降解產(chǎn)生的離子峰明顯較多，說明己二酸的引入更利于共聚物的酶催化降解.

降解產(chǎn)物成分的分析結(jié)果如表1所示.共聚物降解后既產(chǎn)生了含BS單元的小分子物質(zhì)，亦產(chǎn)生了含BA或HS的低聚物，同時(shí)還產(chǎn)生了游離態(tài)的單體，說明PC脂肪酶可以有效的識(shí)別BS型、BA型及HS型酯鍵，從而對(duì)其發(fā)起攻擊使其斷裂.值得注意的是，降解產(chǎn)物中不僅產(chǎn)生了諸如L*(SH)2S(BS)·H+和L*ABSBS·H+的線型小分子物質(zhì)，還產(chǎn)生了聚合度為1的環(huán)狀低聚物.

表1 降解產(chǎn)物成分分析結(jié)果

注：L=線性產(chǎn)物

2.4 種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)中對(duì)幼苗的影響

由表2可以看出，與對(duì)照組相比，PBSA處理組對(duì)青菜種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、根長(zhǎng)、株高、活力指數(shù)、干重等指標(biāo)的促進(jìn)作用均高于空白對(duì)照組，可以說明土壤中加入PBSA有利于青菜種子發(fā)芽，并且對(duì)幼苗的生長(zhǎng)起到了一定的促進(jìn)作用.楊林等[15]研究發(fā)現(xiàn)覆蓋可生物降解地膜對(duì)茶菊的生長(zhǎng)起到了一定的促進(jìn)作用，因此可以說明，PBSA的加入有利于青菜種子的發(fā)芽，并且能夠促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng).

表2 PBSA處理對(duì)青菜種子發(fā)芽的影響

2.5 生長(zhǎng)周期實(shí)驗(yàn)中對(duì)青菜生長(zhǎng)狀況的影響

由表3可知，11 d時(shí)，與對(duì)照組相比，PBSA處理組對(duì)葉片數(shù)無明顯影響，根長(zhǎng)、株高表現(xiàn)出顯著的差異性，分別增加83.6%、14.5%；27 d時(shí)， PBSA處理組對(duì)青菜的影響與11 d一致，根長(zhǎng)及株高分別增加3.5%、9.2%；35 d時(shí)，PBSA處理組對(duì)青菜葉片數(shù)、根長(zhǎng)的影響與對(duì)照組無顯著性差異，株高增加0.87%.隨著青菜生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)，PBSA的降解產(chǎn)物對(duì)青菜葉片數(shù)沒有明顯影響，而對(duì)主根長(zhǎng)和株高的促進(jìn)作用明顯.Gómez等[16]通過研究1-萘乙酸對(duì)根部的影響，發(fā)現(xiàn)根重的增加與1-萘乙酸的添加量成正比，而PBSA在降解過程中產(chǎn)生的低分子量有機(jī)酸與1-萘乙酸化學(xué)性質(zhì)相似，這可以說明PBSA在降解過程中所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物能夠?qū)ΩL(zhǎng)和株高出現(xiàn)應(yīng)激性的促進(jìn)作用.

表3 PBSA對(duì)青菜生長(zhǎng)的影響

時(shí)間/d不同處理葉片數(shù)/片主根長(zhǎng)/cm株高/cm045.58.3CK610.19.511PBSA610.510.2CK1014.820.727PBSA1015.322.6CK1216.322.935PBSA1216.123.1

2.6 生長(zhǎng)周期實(shí)驗(yàn)中對(duì)青菜鮮重、干重的影響

由表4可以看出，與對(duì)照組相比，PBSA處理組對(duì)青菜地上、地下鮮重及地上干重的影響在整個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)均表現(xiàn)出顯著的差異性，呈現(xiàn)促進(jìn)作用，隨著青菜生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)，PBSA處理組對(duì)青菜鮮重、干重的影響與對(duì)照組呈現(xiàn)出顯著性差異，在27 d時(shí)，促進(jìn)作用最明顯，范仲卿等[17]通過研究腐植酸對(duì)油菜生長(zhǎng)發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)腐植酸的加入能夠顯著提高油菜的鮮重、干重.腐植酸是一種顯弱酸性的高分子化合物，而PBSA在降解過程中也會(huì)產(chǎn)生低分子量有機(jī)酸，兩者化學(xué)性質(zhì)相似.因此，可以說明PBSA的加入對(duì)青菜地上、地下部分的干、鮮重質(zhì)量具有促進(jìn)作用.

表4 PBSA對(duì)青菜鮮重、干重的影響

時(shí)間/d不同處理地上鮮重/(mg·株-1)增減/%地下鮮重/(mg·株-1)增減/%地上干重/(mg·株-1)增減/%地下干重/(mg·株-1)增減/%0890.0130.07135.375.9211CKPBSA3 862.704 140.430.007.19460.25467.150.001.50393.92416.070.005.6265.9464.740.00-1.8227CKPBSA39 660.0142 733.020.007.751 249.951 316.670.005.342 579.072 750.700.006.65170.40172.230.001.0735CKPBSA100 050.23102 890.210.002.832 016.462 030.560.000.705 842.945 882.980.000.69245.91250.890.002.03

2.7 生長(zhǎng)周期實(shí)驗(yàn)中對(duì)葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

從圖4可以看出，與對(duì)照組相比，PBSA處理組的蛋白質(zhì)含量在青菜生長(zhǎng)前期低于對(duì)照組含量，隨著生長(zhǎng)周期的延長(zhǎng)，差異性逐漸減小.在11 d時(shí)PBSA處理組對(duì)青菜葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量表現(xiàn)為抑制作用，在27 d時(shí)PBSA處理組對(duì)青菜葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量的抑制作用減小，而在35 d時(shí)PBSA處理組對(duì)青菜葉片中的可溶性蛋白含量的抑制作用消失.陳明霞等[18]通過研究多效唑PP333對(duì)懷地黃葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量的影響，發(fā)現(xiàn)PP333對(duì)葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量具有促進(jìn)作用，PP333是一種醇類物質(zhì)，而PBSA在降解過程中會(huì)產(chǎn)生含有-OH的低聚物，與PP333具有相似的化學(xué)性質(zhì).這說明PBSA在降解過程中，其降解產(chǎn)物能夠參與蛋白質(zhì)的合成和某些酶的活性調(diào)節(jié)，使得前期形成抑制作用逐漸降低，緩解蛋白質(zhì)的降解.

圖4 PBSA對(duì)葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

2.8 生長(zhǎng)周期實(shí)驗(yàn)中對(duì)葉片中葉綠素含量的影響

從圖5可以看出，與對(duì)照組相比，PBSA處理組的葉綠素含量表現(xiàn)出顯著的差異性.在11 d時(shí)PBSA處理組對(duì)青菜葉片中葉綠素質(zhì)量濃度的影響不明顯，隨著青菜生長(zhǎng)周期的延長(zhǎng)，在27 到35 d時(shí)，PBSA處理組對(duì)青菜葉片中葉綠素質(zhì)量濃度促進(jìn)作用逐漸增加.李佳琪等[19]通過研究褐藻寡糖對(duì)黃瓜葉片中葉綠素的影響，發(fā)現(xiàn)褐藻寡糖能夠顯著提高葉綠素含量，褐藻寡糖是由褐藻膠經(jīng)降解后得到的具有-COOH的低聚物，而PBSA在降解過程中也會(huì)產(chǎn)生不同類型的酸性低聚物.這說明，在青菜生長(zhǎng)周期過程中，隨著PBSA的降解，其降解產(chǎn)物對(duì)葉綠素質(zhì)量濃度產(chǎn)生了一定的促進(jìn)作用，且隨著青菜生長(zhǎng)周期的延長(zhǎng)，促進(jìn)作用逐漸明顯.

圖5 PBSA對(duì)葉片中葉綠素含量的影響

2.9 生長(zhǎng)周期實(shí)驗(yàn)中對(duì)葉片中丙二醛(MDA)含量的影響

由圖6可以看出，與對(duì)照組相比，在11 d時(shí)PBSA處理組低于對(duì)照組的MDA含量，在27 d時(shí)PBSA處理組高于對(duì)照組的MDA含量，在35 d 時(shí)PBSA處理組低于對(duì)照組的MDA含量，可以看出在青菜生長(zhǎng)周期內(nèi)，隨著生長(zhǎng)周期的延長(zhǎng)，PBSA處理組對(duì)MDA含量的影響呈現(xiàn)先增加、再降低并趨于穩(wěn)定的趨勢(shì).郭小境等[20]通過研究發(fā)現(xiàn)酸性環(huán)境能夠啟動(dòng)植物體過氧化物酶及其同工酶的工作.這可能因?yàn)樵?7 d前，PBSA的降解產(chǎn)物被植物根部快速吸收，并被運(yùn)輸?shù)街参锏厣喜糠?，使得植物體內(nèi)的活性氧自由基(ROS·)含量上升，在此之后PBSA的降解產(chǎn)物形成的酸性環(huán)境使得植物體內(nèi)過氧化物酶及其同工酶啟動(dòng)，使得植物體內(nèi)的ROS·含量逐漸減少.

圖6 PBSA對(duì)葉片中MDA含量的影響

2.10 生長(zhǎng)周期實(shí)驗(yàn)中對(duì)葉片中過氧化物酶的活性的影響活性的影響

從圖7可以看出，與對(duì)照組相比，前期時(shí)PBSA處理組的POD活性低于對(duì)照組，隨著生長(zhǎng)周期的延長(zhǎng)，POD活性與對(duì)照組的差距逐漸減小，最終達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài).Mekawi等[21]通過研究發(fā)現(xiàn)水楊酸能夠有效提高辣椒果實(shí)的抗氧化性，而PBSA的降解產(chǎn)物多為有機(jī)酸，與水楊酸化學(xué)性質(zhì)相似.這說明，在青菜生長(zhǎng)前期，PBSA的加入對(duì)POD活性的影響不大；而在生長(zhǎng)后期，由于PBSA的降解產(chǎn)物提高了POD活性，使得植物體內(nèi)的ROS·含量逐漸減少，降低了ROS·對(duì)青菜的抗氧化傷害，提高了青菜的抗逆性.

圖7 PBSA對(duì)葉片中POD活性的影響

3 結(jié)論

(1)PBSA的添加有利于青菜種子的發(fā)芽.

(2)在生長(zhǎng)周期過程中，PBSA的添加能夠促進(jìn)植物根部的發(fā)育、加速植株的生長(zhǎng)以及提高葉綠素濃度，并對(duì)葉片中可溶性蛋白質(zhì)的降解過程有效緩解；雖然PBSA在前期會(huì)對(duì)青菜造成過氧化傷害，但是POD活性相應(yīng)的提升能夠提高植物的抗逆性、抵御過氧化傷害.