王 靜， 韓 瑩， 孫玉利， 王夢璐

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

西瓜和蘋果均含有豐富的礦物質(zhì)和多種維生素，且富含多種生物活性成分，如多酚、黃酮、有機(jī)酸，這些活性成分均具良好的保健功能[1,2].因體外模擬胃腸道環(huán)境消化法可以較真實(shí)地模擬食物在人體內(nèi)胃腸道消化過程中的pH和酶環(huán)境，能夠更真實(shí)地模擬人體內(nèi)環(huán)境，比傳統(tǒng)的體外化學(xué)方法更為科學(xué).同時，這種方法還具有周期短、重現(xiàn)性好、節(jié)約資源、易于控制等特點(diǎn).所以在近年來，體外模擬消化已經(jīng)成為眾多研究者們所親睞的研究方法之一.無疑，對西瓜和蘋果進(jìn)行體外模擬抗氧化活性以及變化規(guī)律的深入研究，有利于對它們進(jìn)一步的開發(fā)利用.

自由基具有強(qiáng)氧化性的特點(diǎn)，如機(jī)體中存在過量的自由基，會對機(jī)體的組織和細(xì)胞造成損害，給人體健康帶來危害[3].目前最合理的解決方法是補(bǔ)充外源性抗氧化劑，因?yàn)樵谌藗內(nèi)粘Ｉ钪惺秤玫暮芏嗍澄镏卸己刑烊豢寡趸瘎缙咸?、西瓜、蘋果等水果.因此，日常食品中的抗氧化成分的探究一直是研究熱點(diǎn).

另外，由于消化是人體攝取營養(yǎng)物質(zhì)的關(guān)鍵步驟，而消化系統(tǒng)有其復(fù)雜性，傳統(tǒng)的有機(jī)溶液提取法對食物在人體的轉(zhuǎn)換、降解、不完全釋放等變化過程無法完全掌控[4]，在反映活性物質(zhì)的真實(shí)代謝以及變化規(guī)律上有一定的局限性.但眾多研究表明，體外消化在模擬人體環(huán)境方面表現(xiàn)得更加突出，能夠更加貼近實(shí)際地模擬出食物在人體內(nèi)胃腸道消化過程中的pH和酶環(huán)境.除此之外，使用體外消化還可以節(jié)省大量的試驗(yàn)材料，能夠更好地對操作過程進(jìn)行控制[5]，重現(xiàn)性好.因此，使用體外模擬消化模型來模擬人體的胃腸道消化，能夠?qū)κ称返目寡趸瘍r值做出更準(zhǔn)確、便捷的評價.

目前，圍繞西瓜蘋果等果蔬的功能及活性成分開展的研究很多[6-10]，但基于體外模擬胃腸消化評價其抗氧化活性的研究較少.因此，本研究以西瓜及蘋果為試驗(yàn)材料，利用體外胃腸模擬消化體系，分別檢測了西瓜和蘋果消化前后對各類自由基清除能力的影響，同時對胃腸消化后抗氧化活性的變化規(guī)律進(jìn)行了分析，為西瓜及蘋果的體內(nèi)代謝研究及其資源的開發(fā)利用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：西瓜(品種：京欣)；蘋果(品種：富士).

試劑：DPPH(Sigma-Aldrich)；胃蛋白酶(廣州市左克生物科技發(fā)展有限公司)；胰蛋白酶(廣州市左克生物科技發(fā)展有限公司)；豬膽鹽(北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；其它試劑，如亞硝酸鈉、無水乙醇、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、濃鹽酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉等，均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

水浴恒溫振蕩器(SHZ·82A，上海博珍儀器設(shè)備制造廠)；臺式冷凍離心機(jī)(GT15RT，上海浦東天本離心機(jī)械有限公司)；榨汁機(jī)(MJ-BL25B2,美的);pH 計(ST3100，奧豪斯儀器有限公司)、移液槍(艾本德中國有限公司)；水浴鍋(SHZ.82A，上海博珍儀器設(shè)備制造廠)；全波長掃描式多功能酶標(biāo)儀(varioskan flash，賽默飛世爾科技有限公司).

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

將蘋果及西瓜切為小塊后用榨汁機(jī)榨汁打碎，6000 r/min,4 ℃，4 min，取上清液50 mL[8].

1.3.2 人工胃液和腸液的配制

(1)人工胃液：取稀鹽酸(取鹽酸234 mL，加水稀釋到1 000 mL)16.4 mL，加水約800 mL與胃蛋白酶10 g，搖勻后，調(diào)節(jié)pH至1.3，加水稀釋成1000 mL，即得[11].

(2)人工腸液：取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL使溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉，溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，另取胰酶10 g，25 g豬膽鹽加水適量使溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1 000 mL，即得[12].

1.3.3 體外模擬胃腸消化

模擬胃液、腸液空白對照組：取果汁上清液25 mL，加水1 mL,而后與模擬胃消化試驗(yàn)組共同消化取樣；取模擬胃消化1 h的空白對照組，加入1.5 mL水，而后繼續(xù)消化取樣[13].

模擬胃液消化組：取果汁上清液25 mL于錐形瓶，水浴37 ℃后，1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH=1.3，再加入1 mL模擬胃液，用錫箔紙將錐形瓶包好避光，于37 ℃、轉(zhuǎn)速100 r/min的恒溫水浴搖床消化，于消化的0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h取樣，每次取樣2.5 mL，并將所取樣品迅速置于70 ℃水浴5 min滅活,隨后放至冰箱冷卻，經(jīng)10 000 r/min離心6 min后，取上清液分別測定DPPH自由基、羥基清除能力、亞硝酸根清除能力和還原力[14].

模擬腸液消化組：基于模擬胃消化樣品的分析結(jié)果，模擬胃消化1 h后，作為腸消化的0 h，取稀釋過的蘋果及西瓜上清液20 g于錐形瓶，水浴37 ℃后,經(jīng)過模擬胃消化1 h后，1mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)pH至6.8，加入1.5 mL腸液.用錫箔紙將錐形瓶包好避光，繼續(xù)置于37 ℃、轉(zhuǎn)速100 r/min的恒溫水浴搖床中，持續(xù)消化4 h，于模擬腸消化0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h取樣，每次取樣2.5 g，將所取樣品迅速置于70 ℃熱水浴5 min,隨后放至冰箱冷卻，經(jīng)10 000 r/min離心6 min后，取上清液分別測定.

1.3.4 抗氧化活性

(1)DPPH自由基清除率

DPPH自由基是一個穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在可見光區(qū)波長517 nm處有一強(qiáng)吸收.當(dāng)自由基清除劑加入DPPH溶液中時，由于自由基清除劑提供1個電子使單電子配對，從而使其吸收逐漸消失，褪色程度與接受電子數(shù)呈化學(xué)計量關(guān)系.因此通過吸光度的變化來檢測樣品清除自由基的能力，可以評價樣品的抗氧化能力.200μmol/L的DPPH乙醇溶液的配置：稱取DPPH 15.0 mg加無水乙醇定容至200 mL.

樣品的測定：試驗(yàn)組分別往小試管中加入2 mL樣品梯度液，繼續(xù)加入2 mL DPPH乙醇溶液，充分混合，避光靜置30 min，在波長為517 nm處測定其吸光度.空白組用水代替樣品，用乙醇代替DPPH乙醇溶液作為對照組，避光靜置30 min，漩渦震蕩，517 nm測定其吸光度，各組平行測3次[15].按式(1)計算DPPH自由基清除率：

(1)

式(1)中：C為自由基清除率，A1為試驗(yàn)組(加樣品和試劑)吸光度值，A2為對照組(未加試劑)吸光度值，A0為空白組(未加樣品)吸光度值.

(2)FRAP還原力的測定

抗氧化物質(zhì)將Fe3+還原為Fe2+，F(xiàn)e2+與2，4，6-三(2-吡啶基)三嗪(TPTZ)結(jié)合生成藍(lán)色絡(luò)合物，在波長593 nm處有最大光吸收.吸光度越大，表明抗氧化劑的還原能力越強(qiáng)，因而具有越高的抗氧化活性.

FRAP試劑：將300 mmol/L的醋酸緩沖液(pH=3.6)，10 mmol/L的TPTZ溶液，20 mmol/L的FeCl3·6H2O以10∶1∶1混合(現(xiàn)配現(xiàn)用).

樣品測定：分別取20μL樣液于不同試管，然后各試管加1.8 mL FRAP試劑，混勻，37 ℃水浴10 min，在波長595 nm處測其吸光值.

(3)NO2-清除率的測定

在25 mL具塞試管中，加入一定濃度的樣品溶液2 mL和1 mL NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液(5μg/mL)，并在37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min.取出后立即向其中加入1 mL 0.4%的對氨基苯磺酸混勻，穩(wěn)定靜置5 min后加入0.5 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，加水至10 mL，搖勻后，穩(wěn)定15 min，以樣品溶液為空白測定吸光值，波長為538 nm.通過NaNO2量，標(biāo)準(zhǔn)曲線得出殘留的NaNO2量，并按式(2)計算NO2-清除率：

(2)

式(2)中：ρ為NO2-清除率，n1為NaNO2量，n2為殘留的NaNO2量.

(4)羥自由基清除率的測定

H2O2和Fe2+混合發(fā)生Fenton反應(yīng)，水楊酸可以有效捕獲活性高的羥基自由基，最終生成有色物質(zhì)；如果存在清除作用的物質(zhì)，那么它就會與水楊酸競爭，致使有色產(chǎn)物的生成量減少.

依次向試管中加入待測樣品2 mL(空白組除外)、6 mmol/L FeSO4溶液2 mL(對照組除外)、2.5 mmol/L H2O2溶液2 mL(對照組除外)，搖勻，靜置10 min，再加入6 mmol/L水楊酸乙醇溶液(對照組除外)2 mL，加水定容至10 mL，搖勻，37 ℃水浴30 min，3 000 r/min離心10 min，取上清液測定在510 nm波長下測定值，羥自由基清除率的計算方法參照DPPH自由基清除率公式(1)計算.

1.3.5 數(shù)據(jù)處理方法

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，計算平均值，試驗(yàn)數(shù)據(jù)表示：平均值±標(biāo)準(zhǔn)差.

2 結(jié)果與討論

2.1 消化時間與DPPH自由基清除率的關(guān)系

西瓜和蘋果果汁分別通過胃、腸階段進(jìn)行不同時間的消化后，DPPH自由基清除率的變化情況如圖1、圖2所示.

圖1 西瓜模擬胃腸消化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率

圖2 蘋果模擬胃腸消化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率

由圖可知，在經(jīng)過胃、腸消化后，同等消化條件下，西瓜胃消化DPPH自由基清除率大于腸消化DPPH自由基清除率；蘋果腸消化DPPH自由基清除率大于胃消化.模擬胃消化過程中，西瓜果汁中 DPPH 自由基清除率在消化 1 h 內(nèi)升高并達(dá)到最大值，然后略微下降并趨于穩(wěn)定；蘋果果汁中DPPH自由基清除率在消化1 h內(nèi)顯著升高，隨后又下降，在4 h達(dá)到最大值.模擬腸消化過程中，西瓜果汁中DPPH自由基清除率在消化1 h內(nèi)顯著升高并在消化 2 h時達(dá)到最大值，隨后即開始下降，且在3～4 h時下降幅度較大；蘋果果汁中DPPH自由基清除率先降低后升高并在消化2 h時達(dá)到最大值，然后下降并趨于穩(wěn)定.

西瓜在經(jīng)過腸消化后DPPH自由基清除率小于胃消化組，這可能是因?yàn)槲鞴现泻衅渌寡趸钚猿煞?，如天然色素[2]、有機(jī)酸[16]等，由于天然色素和有機(jī)酸的抗氧化作用都十分強(qiáng)烈，并且這兩者均只能在偏中性的腸液中保留少部分，因而對于DPPH自由基的清除能力略弱.

蘋果在經(jīng)過腸消化后DPPH自由基清除率大于胃消化組，這是因?yàn)樘O果經(jīng)腸消化后可以促進(jìn)多酚釋放，因此腸消化組的DPPH自由基清除率大于胃消化組.

2.2 FRAP還原力的測定

西瓜和蘋果果汁分別通過胃、腸階段進(jìn)行不同時間的消化后，測定了FRAP的還原力情況，如圖3、圖4所示.

圖3 西瓜模擬腸胃消化產(chǎn)物的FRAP濃度

圖4 蘋果模擬腸胃消化產(chǎn)物的FRAP濃度

由圖可知，在模擬胃消化過程中，西瓜的鐵離子還原能力先降低后升高，在0.5 h達(dá)到最高值159.2 mmol/L，2 h達(dá)到最低值；蘋果的鐵離子還原能力在胃消化1 h達(dá)到最大值(580.7 mmol/L)，而后下降，3 h時再次升高，隨后再次下降.在模擬腸消化過程中，消化2 h的樣品其鐵離子還原能力最高58.2 mmol/L，隨后趨于穩(wěn)定；蘋果的鐵離子還原能力基本維持不變(185.1～232.9 mmol/L).對比發(fā)現(xiàn)，西瓜及蘋果模擬消化后鐵離子的還原能力均為胃消化大于腸消化.

由于鐵離子還原能力反映出的是樣品所有的還原能力，而非僅針對于某一自由基的清除活性.因此，由于有機(jī)酸的大量存在，所以腸消化液組的鐵離子還原能力小于胃消化液組[17,18].

2.3 NO2-的清除

西瓜和蘋果果汁分別通過胃、腸階段進(jìn)行不同時間的消化后，測定了對NO2-的清除率的變化情況，如圖5、圖6所示.

圖5 西瓜模擬腸胃消化產(chǎn)物的亞硝酸根清除率

圖6 蘋果模擬腸胃消化產(chǎn)物的亞硝酸根清除率

由圖可知，在模擬胃消化過程中，西瓜的亞硝酸根清除率在消化1 h達(dá)到最高值67.9%；蘋果的亞硝酸根清除率，消化3 h達(dá)到最高值64.0%.模擬腸消化過程中，西瓜果汁消化4 h后的亞硝酸根清除率升高至72.8%，隨后趨于穩(wěn)定；蘋果果汁消化2 h后的亞硝酸根清除率升高至85.1%，隨后趨于穩(wěn)定.經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)，西瓜及蘋果在模擬消化后亞硝酸根清除率均為腸消化大于胃消化.

2.4 消化時間與羥自由基清除率的關(guān)系

西瓜和蘋果果汁分別通過胃、腸階段進(jìn)行不同時間的消化后，測定了對羥自由基清除率的變化情況，如圖7、圖8所示.

圖7 西瓜模擬腸胃消化產(chǎn)物的羥基清除率

圖8 蘋果模擬腸胃消化產(chǎn)物的羥基清除率

由圖可知，在模擬胃消化過程中，在0.5 h時西瓜的羥自由基清除率達(dá)到最大值為 84.1 %，在4 h時其羥自由基清除率下降到最小值；在4 h 時蘋果消化產(chǎn)物的羥自由基清除率上升至最高為 84.6 %，在2 h時蘋果消化產(chǎn)物的羥自由基清除率為最小值.經(jīng)腸消化之后，西瓜消化產(chǎn)物的自由基清除率基本未變，在0.5 h 時即上升至最大值，隨后保持穩(wěn)定；蘋果消化產(chǎn)物在4 h時上升到最大值.經(jīng)過分析對比之后可以發(fā)現(xiàn)，西瓜在模擬消化后，由羥基清除表現(xiàn)出的還原能力：腸消化大于胃消化；而蘋果則為胃消化大于腸消化.

羥自由基(·OH)是在生命活動代謝中源源不斷地產(chǎn)生的，活性氧自由基可占人體內(nèi)自由基總量的95%以上，而且在所有的活性氧自由基中·OH的氧化力最強(qiáng),反應(yīng)速度最快,很容易將糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸和脂類等物質(zhì)氧化，對機(jī)體氧化還原穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生不良影響，同時也對細(xì)胞的正常功能有一定的損害[19,20].

通過模擬胃液的強(qiáng)酸環(huán)境，對氫鍵的穩(wěn)定性造成破壞，進(jìn)而使酚類得到釋放，所以胃消化組的清除羥自由基的能力是大于腸消化組的.

雖體外消化模型依據(jù)的是人體胃腸道而進(jìn)行構(gòu)建的，但在準(zhǔn)確真實(shí)地反映體內(nèi)消化狀況這一方面還存在局限性，同時西瓜及蘋果的組分復(fù)雜，存在多種有機(jī)物.因此，借助體內(nèi)消化系統(tǒng)來研究這兩者在人體胃腸道消化環(huán)境中抗氧化活性等是如何變化的是十分必要的.此外，對抗氧化活性進(jìn)行評價的方法很多不一而足，但結(jié)合本次研究結(jié)論以及相關(guān)文獻(xiàn)報道，發(fā)現(xiàn)對同一組分用不同的評價方法得出的的結(jié)論并不完全一致，所以在研究抗氧化能力時選取不同方法進(jìn)行綜合評價是不可或缺的.

3 結(jié)論

本文研究了在體外模擬胃腸消化過程中西瓜及蘋果抗氧化活性的變化規(guī)律，結(jié)果表明，模擬胃消化可提高西瓜和蘋果的抗氧化活性，且在模擬胃腸消化中，抗氧化活性在消化0.5～1 h內(nèi)升高，約在消化1 h或2 h后達(dá)到最大值，然后逐漸下降,抗氧化活性在腸胃消化后升高.目前，關(guān)于活性成分的研究，傳統(tǒng)的體外化學(xué)法主要是采用化學(xué)溶劑提取活性成分，對其進(jìn)行測量，雖然研究結(jié)果具有一定的科學(xué)價值，但是由于機(jī)體的復(fù)雜環(huán)境，人體內(nèi)的復(fù)雜反應(yīng)并不是簡單的化學(xué)模擬，因此，體外消化模型仍需不斷改進(jìn)提高，以期望更加真實(shí)的反映人體的消化系統(tǒng).本次研究結(jié)果將為西瓜及蘋果的深度開發(fā)和增值加工提供新的理論依據(jù).