王 瑞， 朱文清， 鄭 潔， 張國文*

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌 330047)

許多蛋白質或多肽在一些內部(氨基酸序列變異、氧化應激)，或者外部(極端pH、高溫)因素的共同作用下，會發(fā)生錯誤折疊和聚集，從而形成不溶性淀粉樣纖維。這些蛋白纖維會在體內不斷沉積，產生細胞毒性，對機體器官造成破壞和損傷，從而誘導帕金森氏癥、阿爾茨海默病以及Ⅱ型糖尿病等疾病的發(fā)生[1]。原兒茶酸(Protocatechuic Acid,PA)作為一種酚酸類化合物，廣泛存在于蔬菜和水果中，也是很多天然中草藥的有效成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗血糖、消炎、保護神經等多種藥理學作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，酚酸類化合物咖啡酸[3]、迷迭香酸[4]，以及黃酮化合物根皮素[5]、黃芩素[6]等均能顯著抑制蛋白淀粉樣纖維的形成。紫衫木素通過與蛋白質的氨基酸如賴氨酸(Lys)殘基發(fā)生結合[7]，阻礙Aβ42蛋白的聚集，抑制了蛋白纖維化的生成。然而，關于原兒茶酸對蛋白質淀粉樣纖維化的抑制及可能的抑制機制目前仍不清楚。

本文以人血清白蛋白(HSA)為蛋白模型，采用熒光光譜、圓二色譜(CD)，結合透射電子顯微鏡(TEM)和分子模擬技術，研究了原兒茶酸對蛋白質淀粉樣纖維化的抑制作用及抑制機制，以期為天然酚酸化合物在食品工業(yè)中的應用和藥物開發(fā)提供理論基礎。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

F-7000型熒光光度計(日本，日立公司)；MOS-450型圓二色譜儀(法國，Bio-Logic公司)；JEM-2100型透射電子顯微鏡(日本，電子光學公司)；BSA224S型電子天平(德國，賽多利斯公司)。

HSA(純度≥96%，北京索萊寶科技有限公司)；分別稱取一定量原兒茶酸(PA，純度≥97%，上海阿拉丁有限公司)、硫黃素T(ThT，純度75%，上海源葉生物科技公司)和8-苯氨基-1-萘磺酸(ANS，純度96%，上海阿拉丁有限公司)用無水乙醇溶解，配制成濃度為2.0×10-2、2.0×10-2和1.0×10-4mol·L-1的儲備溶液，于4 ℃冰箱中避光保存；其它試劑均為分析純。實驗用水為Millipore Simplicity水純化系統(tǒng)(法國密理博公司)制備的超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 HSA淀粉樣纖維化的制備稱取適量的HSA溶解于pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液(0.05 mol·L-1)中，配制成濃度為50 μmol·L-1的蛋白溶液，放置在4 ℃的冰箱中過夜以充分溶解。取不同體積的原兒茶酸儲備液加入到HSA蛋白溶液中，原兒茶酸的終濃度分別為250 μmol·L-1和500 μmol·L-1。將上述溶液充分混勻后，置于65 ℃的恒溫水浴鍋中孵育，分別在1、2、4、8、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h時取樣，待測。

1.2.2 ThT熒光光譜測定向2 mL不同時間段取出的HSA樣品溶液中加入5 μL ThT儲備溶液，充分振蕩搖勻后，置于暗處反應30 min，將反應后的試液倒入熒光池中，在440 nm的激發(fā)波長下，測定450～650 nm 范圍內的熒光光譜，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為2.5 nm。

1.2.3 ANS熒光光譜測定將孵育后的HSA樣品用緩沖溶液稀釋至5.0 μmol·L-1后，加入一定體積的ANS儲備溶液，保證ANS與蛋白的濃度比為10∶1，避光反應30 min后，測定ANS熒光光譜。激發(fā)波長設定為380 nm，掃描范圍為400～600 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為2.5 nm。

1.2.4 CD測定采用CD儀測定HSA溶液孵育前后二級結構的變化。在室溫條件下，將稀釋的蛋白溶液(5.0 μmol·L-1)加入到石英比色皿中進行測定，波長掃描范圍為190～250 nm，每組樣品測量3次，通過扣除緩沖溶液的背景光譜來校正所測得的CD光譜。

1.2.5 TEM測定將孵化前后的HSA溶液用緩沖液稀釋到5.0 μmol·L-1，輕微振蕩后使其分散均勻，取20 μL稀釋后的HSA溶液滴于帶有碳支撐膜的銅網上，靜置蒸發(fā)干燥后，滴加1%磷鎢酸負染5 min，用濾紙吸去多余的磷鎢酸，于37 ℃干燥箱中過夜。采用TEM觀察蛋白纖維化程度。

1.2.6 分子模擬使用AutoDock 4.2和MGLTools 1.5.6軟件模擬原兒茶酸與HSA的結合模式。配體分子原兒茶酸的3D結構通過Chem3D Ultra 8.0軟件構建，并進行能量最小優(yōu)化。HSA的晶體結構從Protein Data Bank網站下載(1h9z)，除去HSA的水分子，并將極性氫原子加入到HSA中。將處理好的原兒茶酸與HSA進行分子對接，并應用Lamarckian遺傳算法完成對接計算，對接次數(shù)為100次，運行結束后，形成一系列的能量簇，根據(jù)能量最優(yōu)原則選擇最合適的對接模型進行結果分析。

圖1 (A)不同濃度原兒茶酸存在下HSA淀粉樣蛋白聚集的ThT熒光動力學；(B)65 ℃孵育120 h后HSA纖維化的ThT熒光光譜Fig.1 (A) ThT fluorescence kinetics of HSA in the absence and presence of difference concentrations of PA;(B) ThT fluorescence spectra of HSA fibrillation after incubation at 65 ℃ over 120 h in the absence and presence of PA

2 結果與討論

2.1 原兒茶酸對HSA淀粉樣纖維聚集的抑制

ThT作為一種陰離子熒光染料，能夠與淀粉樣纖維的β片層結構特異性結合，在440 nm波長激發(fā)條件下產生熒光，ThT熒光值的大小常被用作評估蛋白淀粉樣纖維程度的指標[8]。如圖1(A)所示，不同于大多數(shù)蛋白質纖維化過程呈現(xiàn)出的核依賴聚集模型，HSA的纖維化過程不包括成核期[9]，直接形成原纖維并結合捆綁形成成熟的淀粉樣纖維(生長期，0～84 h)，當體系中所有的蛋白質單體均轉化為成熟淀粉樣纖維后，ThT的熒光強度趨于穩(wěn)定(穩(wěn)定期，84～120 h)，孵化120 h后的ThT熒光強度為304.8(圖1(B)曲線1)。加入不同濃度的原兒茶酸與HSA孵化后可明顯降低蛋白淀粉樣纖維的生成量，當原兒茶酸的濃度為250 μmol·L-1和500 μmol·L-1時，ThT熒光強度分別降低至174和122.7(圖1(B)曲線2、3)，對HSA淀粉樣纖維形成的抑制率分別達到了42.5%和59.5%。該結果初步證明了原兒茶酸對蛋白質淀粉樣纖維的形成有良好的抑制作用，且呈現(xiàn)出濃度依賴性。

2.2 原兒茶酸對HSA淀粉樣纖維表面疏水性的影響

研究表明，蛋白質在不斷聚集形成纖維化的過程中，常伴隨著蛋白質結構的部分解折疊，誘導蛋白質內部疏水性氨基酸的暴露[10]。ANS作為一種典型的疏水性探針，本身熒光強度較弱，當其作用于蛋白質的疏水性氨基酸，其熒光強度會顯著增強[11]。如圖2所示，25 ℃下HSA-ANS體系熒光強度較低(119.3，曲線1)，說明常溫下HSA內部疏水性氨基酸不會暴露出來，而在65 ℃孵化120 h后的HSA-ANS體系熒光強度明顯升高(651.9，曲線2)，并伴隨著顯著的藍移(486 nm→479 nm)，表明孵化后的HSA表面暴露出較多的疏水性氨基酸殘基。當在整個蛋白質孵化體系(65 ℃,120 h)中加入濃度為250和500 μmol·L-1的原兒茶酸后，反應體系的熒光強度為374.4(曲線3)和264(曲線4)，分別降低了42.6%和59.5%。該結果表明原兒茶酸誘導了HSA多肽鏈的收縮，從而即便在較高溫度下(65 ℃)也能維持蛋白質正常的結構穩(wěn)定性。有文獻報道，小分子與蛋白質的非共價結合能夠穩(wěn)定淀粉樣纖維蛋白的核心結構[12]，因此，我們推測原兒茶酸可能與HSA的氨基酸殘基發(fā)生非共價結合而抑制了HSA纖維的形成。

2.3 原兒茶酸對HSA二級結構的影響

研究表明，在正常蛋白向成熟的淀粉樣纖維變化過程中，伴隨著蛋白質二級結構中α-螺旋向β-折疊的轉變[13]。圖3顯示未經孵化的HSA在208 nm和222 nm處有兩個明顯的特征吸收峰，表明在HSA結構中α-螺旋占主導地位。當HSA在65 ℃下孵化120 h后，HSA在222 nm處的吸收峰消失，強度減弱，表明HSA的二級結構由α-螺旋向β-折疊轉變[14]。當向上述孵化的HSA溶液中加入原兒茶酸后，HSA的CD光譜橢圓度逐漸恢復，且呈現(xiàn)濃度依賴關系，表明原兒茶酸的加入能夠阻止蛋白質二級結構由α-螺旋向β-折疊轉變，原兒茶酸通過穩(wěn)定蛋白質的α-螺旋結構而發(fā)揮其抑制淀粉樣纖維作用[14]。

圖2 不同濃度原兒茶酸在65 ℃下孵化120 h后對HSA表面疏水性的影響Fig.2 Effect of difference concentrations of PA on the surface hydrophobicity of HSA after incubation at 65 ℃ for 120 hcurves 1 - 4:1.HSA at 25 ℃(5.0 μmol·L-1);2.HSA at 65 ℃(5.0 μmol·L-1) for 120 h;3.HSA+PA(250 μmol·L-1) at 65 ℃ for 120 h;4.HSA+PA(500 μmol·L-1) at 65 ℃ for 120 h.

圖3 不同濃度原兒茶酸在65 ℃下孵化120 h后對HSA二級結構的影響Fig.3 Effects of difference concentrations of PA on the secondary structure of HSA after incubation at 65 ℃ for 120 h

采用在線的Dichroweb軟件分析[15]得到HSA的二級結構含量(表1)。由表可以看出，孵化后的HSA中α-螺旋含量明顯降低(46.9%→37.9%)，β-折疊含量顯著增大(2.1%→11.6%)，而加入原兒茶酸(500 μmol·L-1)與HSA共同孵化后，α-螺旋含量從37.9%恢復到43.3%，β-折疊含量也從11.6%降低到5.3%，進一步證實了原兒茶酸具有穩(wěn)定蛋白質α-螺旋結構的能力，這也可能是其能夠抑制蛋白淀粉樣纖維化的原因之一。

表1 HSA和原兒茶酸-HSA體系的二級結構含量

2.4 原兒茶酸對HSA淀粉樣纖維形態(tài)的影響

為了更直觀的觀察HSA淀粉樣纖維化的形成以及評估原兒茶酸對蛋白淀粉樣纖維化的抑制效果，采用TEM觀察HSA溶液中蛋白的形態(tài)變化[16]。如圖4A所示，常溫下的HSA溶液中未觀察到纖維的形成，經過65 ℃孵化120 h的蛋白溶液則形成了直的成熟淀粉樣纖維，并產生聚集形成濃密的網狀結構(圖4B)。在加入原兒茶酸孵化后該蛋白溶液的纖維化程度明顯減弱，當加入的原兒茶酸濃度達到500 μmol·L-1時，幾乎觀測不到明顯的纖維狀蛋白，原兒茶酸與蛋白結合形成了顆粒狀的聚集體(圖4C和4D)。TEM結果與ThT熒光測量結果相符，證實原兒茶酸具有良好的抑制蛋白淀粉樣纖維形成的能力。

圖4 HSA淀粉樣纖維的TEM圖像(200 nm).(A) 25 ℃的HSA;(B) 65 ℃孵化120 h的HSA;(C) HSA+PA(250 μmol·L-1) 65 ℃孵化120 h;(D) HSA+PA(500 μmol·L-1) 65 ℃孵化120 hFig.4 TEM images of HSA amyloid fibrils(200 nm).(A) HSA at 25 ℃;(B) HSA incubated at 65 ℃ for 120 h;(C) HSA+PA(250 μmol·L-1) incubated at 65 ℃ for 120 h;(D) HSA+PA(500 μmol·L-1) incubated at 65 ℃ for 120 h

2.5 原兒茶酸與HSA分子對接

原兒茶酸與HSA分子對接顯示，原兒茶酸進入了HSA子域ⅢB和子域ⅠB之間的疏水空腔(圖5(A))，被Glu184,Arg186,Asp187,Lys190,Arg428,Lys432,Ser435,Lys436,Lys519,Gln522,Ile523,Gln526和Thr527等氨基酸殘基包圍，且分別與Lys432和Lys519形成兩個氫鍵，鍵長分別為2.202 ?和2.234 ?(圖5(B))，表明原兒茶酸通過氫鍵和疏水作用力與HSA發(fā)生結合，這種結合有助于維持蛋白質結構的穩(wěn)定，阻礙蛋白質的聚集，從而抑制蛋白質淀粉樣纖維化的形成。Sato等[7]報道，兒茶酚型黃酮類化合物紫杉葉素通過結合Aβ42的賴氨酸殘基(Lys)而抑制Aβ42多肽的聚集。由此推測原兒茶酸可能與紫杉葉素類似，通過與賴氨酸殘基特異性結合而抑制蛋白質聚集和淀粉樣纖維化的形成。

圖5 (A) 原兒茶酸與HSA最可能結合位點；(B) HSA疏水性空腔中與原兒茶酸作用的氨基酸殘基Fig.5 (A) The most possible binding site of PA in HSA;(B) Interaction of PA with the amino acid residues in the hydrophobic pocket of HSA

3 結論

原兒茶酸對HSA淀粉樣纖維化的抑制呈現(xiàn)濃度依賴性，當濃度為500 μmol·L-1時，其抑制率達到了59.5%。原兒茶酸主要通過氫鍵和疏水作用力與HSA發(fā)生結合，減少蛋白質表面疏水性氨基酸的暴露，使得蛋白質在較高溫環(huán)境(65 ℃)下也能夠維持正常的構象。原兒茶酸可能通過與HSA中的賴氨酸殘基的特異性結合而穩(wěn)定蛋白質結構，從而抑制蛋白質聚集，減少淀粉樣纖維化的形成。該研究結果可為原兒茶酸作為新型抗淀粉樣蛋白抑制劑的研發(fā)提供一定的理論基礎。