茅 龍， 汪 耀， 何振宇*， 林亞維*

(1.武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430070；2.武漢市洪山區(qū)疾病預(yù)防控制中心，湖北武漢 430060)

在葡萄酒的釀造和陳化中，氧化作用十分重要，它可改變葡萄酒色澤和香氣并產(chǎn)生多種揮發(fā)性物質(zhì)[1 - 3]，這些物質(zhì)就含有芳香醛類化合物。芳香醛雖然在葡萄酒中含量較低，但可對葡萄酒的香氣產(chǎn)生很大影響[4，5]，因此對葡萄酒中的芳香醛進(jìn)行檢測是極具意義的。醛類化合物檢測常用的方法是氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)和液相色譜法(LC)。GC-MS法具有良好的分離和檢測的能力，但醛類化合物的穩(wěn)定性差，需要對其進(jìn)行衍生[6 - 12]。而且葡萄酒基質(zhì)較為復(fù)雜，還需要復(fù)雜的樣品前處理步驟，如固相萃取、固相微萃取[13 - 15]等。此外，GC-MS法儀器價格較為昂貴，這也限制了該方法的廣泛應(yīng)用。相較于GC-MS法，高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLD)受基質(zhì)影響較小，但部分醛類化合物熒光較弱，因此可通過衍生化來增強(qiáng)其光學(xué)響應(yīng)。熒光衍生試劑衍生結(jié)合HPLC-FLD法檢測可極大提高檢測靈敏度，常用試劑有丹磺酰肼(DNSH)[16，17]，但是該法通常需要加熱不利于揮發(fā)性醛類，而且產(chǎn)物還存在同分異構(gòu)現(xiàn)象。

本研究利用熒光衍生試劑4-氨氧基甲基-7-羥基-香豆素(AOHC)，發(fā)展了一種新型醛類熒光衍生化方法，利用硼烷-2甲基吡啶絡(luò)合物(2-PB)[18]的還原作用可以得到結(jié)構(gòu)單一的衍生產(chǎn)物(圖1)。我們通過對多個衍生條件參數(shù)的優(yōu)化得到了較高的衍生化效率，并將該方法成功用于葡萄酒分析。本方法分離效果好，準(zhǔn)確性高，不需要復(fù)雜的萃取步驟，為葡萄酒中芳香醛類合物的分析提供了一種可行的方法選擇。

圖1 4-氨氧基甲基-7-羥基-香豆素(AOHC)標(biāo)記芳香醛示意圖Fig.1 Derivatization of aromatic aldehyde with 4-((aminooxy)methyl)-7-hydroxycoumarin(AOHC)

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-20AT高效液相色譜儀(日本，Shimadzu公司)；LS-55熒光分光光度計(美國，Perkin Elmer公司)；納升電噴霧離子源-Triple TOFTM5600質(zhì)譜儀(美國，AB SCIEX公司)；PB-10 pH計(德國，Sartorius公司)。

4-氨氧基甲基-7-羥基-香豆素(AOHC)由本實驗室合成；苯甲醛(B1)、磷酸、冰HAc(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；丁醛(C4)、戊醛(C5)、己醛(C6)、乙酸胺、2-氨基-5-甲氧基-苯甲酸、硼烷-2-甲基吡啶絡(luò)合物(2-PB)(分析純，北京百靈威科技有限公司)；庚醛(C7)、苯乙醛(B2)、苯丙醛(B3)、二甲基亞砜(DMSO)(分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；乙腈(色譜純，美國TEDIA公司)；純水(經(jīng)Milli-Q系統(tǒng)純化)。

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1.2 實驗方法

1.2.1 AOHC的熒光性質(zhì)分析在1 mL DMSO中溶解2.07 mg AOHC，再用10%乙腈水溶液稀釋至2 μmol/L。測量發(fā)射波長時，設(shè)定激發(fā)波長為325 nm，掃描波長范圍為350～600 nm；測量激發(fā)波長時，設(shè)定發(fā)射波長為480 nm，掃描波長范圍為250～450 nm。

1.2.2 AOHC與三種芳香醛衍生反應(yīng)將10 μL混合醛(苯甲醛、苯乙醛和苯丙醛各0.01 mmol/L，溶于純甲醇)與20 μL 0.1 mmol/L的AOHC(溶于純甲醇)，加入到1.5 mL EP管中，再向其中加入10 μL HAc-NH4Ac緩沖液 (0.1 mol/L，pH=5.0)和10 μL 20 mmol/L 2-氨基-5甲氧基-苯甲酸(溶于純甲醇)，混合均勻后，置于25 ℃的水浴鍋中反應(yīng)10 min，然后離心真空干燥，再加入25 μL的2-PB(0.4 mol/L，純乙腈溶劑)和25 μL的磷酸溶液 (1.25 mol/L，純乙腈溶劑)，于室溫下反應(yīng)5 min，然后取出離心真空干燥，最后加入50 μL水，待HPLC-FLD分析。

1.2.3 高效液相色譜條件ZORBAX Eelipse XDB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm;美國Agilent)；流動相A為純水，流動相B為乙腈；洗脫程序為：0～10 min，30%B；15～30 min，95%B；33～38 min，30%B。 熒光檢測器的激發(fā)和發(fā)射波長分別設(shè)定為325與480 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：20 μL；流速：1 mL/min。

1.2.4 高分辨質(zhì)譜分析采用納升電噴霧離子源-Triple TOFTM5600(AB，SCIEX)質(zhì)譜儀對所有的衍生產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜分析采用的是正離子模式，二級質(zhì)譜分析采用的是IDA(Information Dependent Acquisition)模式。Peak View 1.2 軟件用于分析所得到的數(shù)據(jù)。

1.2.5 葡萄酒樣品的衍生反應(yīng)取200 μL酒樣過0.22 μm濾膜并用甲醇稀釋10倍后，進(jìn)行AOHC衍生，衍生操作見1.2.2，最后直接進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 AOHC熒光特性

首先對 AOHC熒光性質(zhì)進(jìn)行表征，結(jié)果見圖2，確定了激發(fā)和發(fā)射波長分別為325 nm和480 nm。然后對AOHC的熒光量子產(chǎn)率進(jìn)行測定(以硫酸奎寧為標(biāo)準(zhǔn)參照物)，最終測得熒光量子產(chǎn)率為0.63，這說明AOHC具有良好的熒光特性。實驗對3種衍生產(chǎn)物進(jìn)行了熒光性質(zhì)的測定(圖2)，3種芳香醛衍生物的熒光激發(fā)發(fā)射波長與AOHC相似，說明衍生反應(yīng)沒有改變AOHC的熒光性質(zhì)。

2.2 衍生產(chǎn)物的確定

使用HPLC-FLD對芳香醛衍生反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測，見圖3。對比空白樣與反應(yīng)樣的色譜圖，觀察到3個可能的產(chǎn)物的色譜峰，保留時間分別為6.1、9.0和13.0 min。

對圖3中這3個色譜峰依次進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，3個色譜峰的[M+H]分別為m/z298.10、312.12和326.14，這與三種芳香醛衍生物的[M+H]+理論值吻合。此外，我們在3種衍生物的二級質(zhì)譜圖中均觀察到了m/z176.04的碎片峰，如圖4所示。這個碎片峰是AOHC的特征碎片峰，進(jìn)一步表明了AOHC成功地對三種芳香醛進(jìn)行了標(biāo)記。

圖2 AOHC與三種芳香醛衍生產(chǎn)物熒光光譜圖Fig.2 The fluorescence spectra of isolated AOHC,B1-derivative,B2-derivative and B3-derivative

圖3 3種衍生產(chǎn)物AOHC-B1、AOHC-B2和AOHC-B3色譜圖Fig.3 Chromatogram of AOHC-B1,AOHC-B2 and AOHC-B3(2 μmol/L each)

圖4 AOHC-B1(A)、AOHC-B2(C)、AOHC-B3(E)衍生產(chǎn)物一級質(zhì)譜圖；AOHC-B1(B)、AOHC-B2(D)和AOHC-B3(F)二級質(zhì)譜圖Fig.4 ESI-MS of AOHC-B1(A),AOHC-B2(C) and AOHC-B3(E) derivatives;ESI-MS/MS of AOHC-B1(B),AOHC-B2(D) and AOHC-B3(F) derivatives

2.3 還原氨氧化反應(yīng)條件的優(yōu)化

首先，在采用4 mmol/L 2-氨基-5-甲氧基-苯甲酸[23]為催化劑的條件下，對第一步氨氧化反應(yīng)的其他條件進(jìn)行了優(yōu)化(圖5A～D)，包括反應(yīng)時間優(yōu)化，反應(yīng)體系pH值優(yōu)化，反應(yīng)溫度優(yōu)化和AOHC濃度優(yōu)化。最佳的反應(yīng)條件為：氨氧化反應(yīng)時間為10 min，反應(yīng)體系的pH為5.0，反應(yīng)溫度為25 ℃，AOHC濃度為40 μmol/L。在完成對第一步肟化反應(yīng)的優(yōu)化后，對第二步還原氫化進(jìn)行了優(yōu)化(見圖5E～H)。主要包括還原反應(yīng)時間優(yōu)化、還原反應(yīng)溫度優(yōu)化、磷酸濃度和2-PB濃度優(yōu)化。最佳的還原條件為：反應(yīng)時間為5 min，反應(yīng)溫度為25 ℃，磷酸濃度為0.625 mol/L，2-PB濃度為200 mmol/L。

圖5 不同反應(yīng)條件對產(chǎn)物峰面積的影響。(A) 氨氧化反應(yīng)時間影響,(B) 反應(yīng)體系pH影響,(C) 氨氧化反應(yīng)溫度影響,(D) AOHC濃度影響,(E) 反應(yīng)時間影響,(F) 反應(yīng)溫度影響,(G) H3PO4濃度影響,(H)2-PB濃度影響Fig.5 Effect of derivatization conditions on peak areas of the derivatives,including(A) effect of the oximation reaction time,(B) effect of buffer pH,(C) effect of the oximation reaction temperature,(D) effect of the concentration of AOHC,(E) effect of the reducation reaction time,(F) effect of the reducation reaction temperature,(G) effect of the concentration of H3PO4,(H) effect of the concentration of 2-PB

2.4 分析方法的驗證

標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過分析不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)芳香醛混合物的峰面積而建立起來的，分別計算檢出限(LOD，S/N=3)和定量限(LOQ，S/N=10)。線性是由從LOQs開始到2 μmol/L不同混合醛濃度計算得出。日內(nèi)精密度(RSD)在1 d之內(nèi)連續(xù)測6個相同的反應(yīng)樣，日間RSD是使用相同的分析方法，每天測6個樣，連續(xù)測3 d。3種芳香醛化合物的濃度范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)以及檢測限見表1。

表1 AOHC分析3種芳香醛所得線性范圍、線性方程、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和檢出限

aY:peakarea(mV·min)，X:concentration(nmol/L).

圖6 (A) 苯甲醛、苯乙醛、苯丙醛和4種脂肪醛與AOHC衍生產(chǎn)物色譜圖(其中B1為苯甲醛，B2為苯乙醛，B3為苯丙醛，C4為丁醛，C5為戊醛，C6為己醛，C7為庚醛);(B) 葡萄酒樣品與AOHC衍生產(chǎn)物HPLC-FLD色譜圖((a) 未加標(biāo)實際樣品,(b) 加標(biāo)實際樣品 (B1、B2加標(biāo)濃度分別為0.2 μmol/L))Fig.6 (A) Representative chromatogram of a standard mixture of 3 aryl aldehydes spiked with 8 aliphatic aldehydes and 2 monosaccharides.Shown are the derivatives of C3,C4,B1,B2,C5,B3,C6 and C7;(B) Typical chromatograms for the determination of aryl aldehyde using the proposed method(a) unspiked wine sample,(b) wine sample spiked with B1 and B2 standards(0.2 μmol/L respectively)

2.5 抗干擾實驗

考慮到實際樣品中其他醛類化合物的存在會對芳香醛類化合物的檢測產(chǎn)生干擾，將丁醛、戊醛等4種脂肪醛和3種芳香醛化合物混合，然后再進(jìn)行衍生，采用HPLC-FLD進(jìn)行分析檢測。并對之前的色譜分離條件進(jìn)行了調(diào)整，其結(jié)果如圖6所示。我們可以看到所有醛類化合物的衍生產(chǎn)物都得到了良好的分離，這說明AOHC可以與不同的醛類化合物進(jìn)行反應(yīng)，并產(chǎn)生色譜特性不同的穩(wěn)定的衍生產(chǎn)物。

2.6 實際樣品分析

將該方法應(yīng)用于葡萄酒樣品中的芳香醛檢測。將處理后的葡萄酒與AOHC直接進(jìn)行衍生，然后進(jìn)行HPLC-FLD分析。在葡萄酒樣品中，檢測到了苯甲醛和苯乙醛，并沒有檢測到苯丙醛。這兩種產(chǎn)物峰分離效果較好，沒有受到基質(zhì)影響。采用外標(biāo)法，對葡萄酒樣品中的芳香醛進(jìn)行了定量分析。結(jié)果顯示，葡萄酒樣品中苯甲醛和苯乙醛含量分別為0.12、0.18 mg/L。這一結(jié)果與Moreira等人[24]利用GC-MS法所測結(jié)果相似。本方法常溫下衍生即可檢測，不需任何萃取步驟，極大地簡化了分析流程。其他結(jié)果如表 2所示，回收率為94.08%～107.54%，日內(nèi)精密度(RSD)為2.25%～4.50%，日間RSD為4.03%～6.07%，表明該方法準(zhǔn)確度高。

表2 葡萄酒樣品中醛類物質(zhì)的回收率，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差及含量

arecovery(%)：average±SD。

2.7 與DNSH衍生法的比較

將AOHC衍生法與常用的DNSH衍生法進(jìn)行了比較，分別比較了3種芳香醛與AOHC和DNSH標(biāo)記的效果。首先比較了AOHC與DNSH衍生產(chǎn)物的色譜峰，AOHC衍生之后，每種芳香醛僅生成1種衍生物，而DNSH衍生后每種芳香醛都生成了2種衍生產(chǎn)物。

比較了DNSH與AOHC標(biāo)記之后3種芳香醛衍生物的峰面積大小，AOHC對于3種芳香醛的衍生效果較DNSH要好，其衍生產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度是DNSH衍生產(chǎn)物的13倍以上。

3 結(jié)論

本文采用熒光試劑AOHC,發(fā)展了一種新型醛類衍生化方法并將之成功應(yīng)用于葡萄酒中芳香醛的檢測。通過衍生條件優(yōu)化，三種芳香醛衍生效率在89.6%以上。與常用的DNSH衍生化法相比，本方法可以在室溫下進(jìn)行并生成結(jié)構(gòu)單一的，具有良好色譜、熒光性質(zhì)的醛類衍生產(chǎn)物。采用該方法對葡萄酒中芳香醛進(jìn)行測定，成功檢測出0.12 mg/L的苯甲醛與0.18 mg/L的苯乙醛。該法操作簡單，無需萃取富集步驟，極大地節(jié)約了時間和分析成本，在醛類化合物檢測中極具應(yīng)用前景。