劉元元， 李 靜， 王 彥， 閆 超*,

(1.上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240;2.上海通微分析技術(shù)有限公司，上海 201203)

開管毛細(xì)管電色譜(Open Tubular Capillary Electrochromatography,OT-CEC) 是一種新興的在毛細(xì)管內(nèi)表面涂覆或鍵合固定相，以電滲流為主要驅(qū)動力的色譜微分離技術(shù)[1]。它兼具了毛細(xì)管電泳(Capillary Electrophoresis,CE)和高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)雙重作用機(jī)理，與HPLC相比，柱塞型的電滲流代替壓力流，可以抑制樣品擴(kuò)散、提高柱效，而且其開放型的分離通道可以避免液相色譜柱堵塞、重復(fù)性差等問題；與CE相比，由于毛細(xì)管柱表面色譜固定相的存在，可以發(fā)揮液相色譜的高選擇性優(yōu)勢，同時還可以抑制樣品的吸附，尤其是在生物大分子或堿性物質(zhì)(帶正電)的分離分析中具有極好的應(yīng)用前景。

固定相是制備毛細(xì)管電色譜開管柱的核心和瓶頸。SiO2納米材料，尤其是有序介孔SiO2納米材料(Mesoporous Silica Nanoparticles,MS NPs)，不僅具有化學(xué)穩(wěn)定性好、易于修飾、孔徑分布窄、孔結(jié)構(gòu)均一可調(diào)等特點(diǎn)[2,3]，而且具有出色的比表面積(>1 600 m2/g)[4]，可以用來接枝各種功能性基團(tuán)或配體，如氨基[5]、巰基、烷基和環(huán)糊精[6]，近年來作為色譜材料被廣泛地用于氣相色譜[7]、液相色譜[4,8,9]、離子色譜[10]、親和色譜[11，12]以及電色譜[13]等各個領(lǐng)域。例如，Tian等[14]利用合成的亞微米SBA-15制備電色譜填充柱，應(yīng)用于苯類同系物、苯胺類化合物以及堿性藥物的分離，柱效達(dá)210 000N/m。Dong等[15]利用纖維素修飾的基于MCM-41的開管柱，可以成功應(yīng)用于安息香類化合物的手性分離。

本文設(shè)計并合成了一種基于纖維狀介孔二氧化硅納米(fSiO2)和聚合物(DMAEMA polymer)的材料(P-fSiO2)，將該材料通過物理吸附的方式涂覆到毛細(xì)管內(nèi)壁，制備了新型的毛細(xì)管電色譜開管柱(P-fSiO2開管柱)。在考察電滲流等條件的基礎(chǔ)上，并將其首次應(yīng)用于磺胺吡啶(SP)等8種磺胺類堿性物質(zhì)(圖1)的開管毛細(xì)管電色譜(OT-CEC)分離分析，以考察其電色譜性能?；前奉惪股卮蠖嗪谢酋０坊桶被葔A性基團(tuán)，目前多采用反相高效液相色譜等[16]分離方法，而OT-CEC分離分析磺胺類化合物的方法在國內(nèi)外還未見報道。

圖1 8種磺胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of 8 sulfonamides

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑和材料

S-4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)(日本，Hitachi公司)；JEOL-2100F場發(fā)射透射電子顯微鏡(TEM)(日本，電子株式會社)；Sartorius BT224S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；KQ5200DE型超聲波清洗(昆山市超聲儀器有限公司)；D2F-1B真空干燥箱(上海博泰實驗設(shè)備有限公司)；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器(河南鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；DM36-12馬弗爐(上海德恭實業(yè)有限公司)；電阻絲加熱器(蘇州環(huán)球色譜有限責(zé)任公司)。

磺胺吡啶(SP)、磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺喹惡啉(SQX)、磺胺甲氧噠嗪(SMP)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺二甲異惡唑(SIZ)、磺胺嘧啶(SD)8種標(biāo)準(zhǔn)品購自阿拉丁試劑(上海)有限公司?；前窐?biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取磺胺吡啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉、磺胺甲氧吡啶嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲異惡唑、磺胺嘧啶各10.0 mg，加入色譜純乙腈定容至10.0 mL，配成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用時取適量混合再稀釋到所需濃度，過0.22 μm濾膜，并置于4 ℃避光保存。無水乙醇、丙酮、尿素、環(huán)己烷、異丙醇、硼砂、Na2HPO4、NaOH、HCl、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、正硅酸四乙酯(TEOS)等均購買于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海)；無水二氯甲烷、CuCl2、CuCl、2-溴異丁酰溴、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、2,2′-聯(lián)吡啶(BPY)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯(DMAEMA)等均購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；甲醇、乙腈(色譜純)購自Tedia公司。熔融石英毛細(xì)管(50 μm i.d.,363 μm o.d.)購自河北永年銳灃色譜器件有限公司。純水由Milli-Q純化系統(tǒng)(美國，Millipore)制備。

1.2 P-fSiO2的合成

首先合成纖維狀介孔二氧化硅納米材料(fSiO2NPs)。在裝有磁力攪拌器、回流冷凝管、溫度計和滴液漏斗的250 mL四頸瓶中，加入0.5 g(1.3 mmol)CTAB、0.3 g(5.0 mmol)尿素和15 mL純水，開動攪拌使其溶解后，分別加入15 mL環(huán)己烷和0.46 mL(6.0 mmol)異丙醇，隨后緩慢滴加1.25 g(6.0 mmol)TEOS并劇烈攪拌30 min，加熱使溶液溫度達(dá)到72 ℃，反應(yīng)10 h。反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)液冷卻至室溫，以5 000 r/min離心3 min，用純水和丙酮分別洗滌3次，60 ℃干燥24 h。最后將合成的固體轉(zhuǎn)移至50 mL 0.6%NH4NO3-乙醇溶液中，60 ℃回流4 h除去模板劑CTAB。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，用乙醇洗滌3次，60 ℃干燥24 h，得到白色纖維狀介孔二氧化硅納米材料(fSiO2)。

通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(Atom Transfer Radical Polymerization,ATRP)法將DMAEMA接枝到除去模板的fSiO2上。將1.0 gfSiO2加入到含有0.06 mol/L APTES的 50 mL無水乙腈中，25 ℃反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，以5 000 r/min離心3 min，乙腈洗滌3次，60 ℃干燥得到氨基化fSiO2(NH2-fSiO2)。將1.0 g NH2-fSiO2加入到含有0.15 mol/L三乙胺，0.13 mol/L 2-溴異丁酰溴以及催化量DMAP的50 mL無水二氯甲烷中，25 ℃反應(yīng)12 h。結(jié)束后，以5 000 r/min離心3 min，二氯甲烷洗滌3次，60 ℃干燥得到溴化-氨基化f-SiO2(Br-NH2-f-SiO2)。最后，將1.0 g Br-NH2-fSiO2加入到10 mL甲醇-水(2∶1,V/V)溶液中，超聲溶解后，加入0.5 mol/L DMAEMA，0.08 mol/L BPY，0.006 mol/L CuCl2和0.02 mol/L CuCl，室溫反應(yīng)12 h后，用純水洗滌至無色，60 ℃干燥得到DMAEMA-fSiO2(P-fSiO2)。

P-fSiO2的合成路線如圖2所示。

圖2 P-fSiO2合成示意圖Fig.2 Synthesis DMAEMA-modified of silica nanoparticles

1.3 P-fSiO2開管柱的制備

毛細(xì)管預(yù)處理：將總長度65 cm，有效長度45 cm，50 μm i.d.的熔融石英毛細(xì)管依次用甲醇(30 min)、純水(5 min)、0.1 mol/L NaOH溶液(60 min)、純水(5 min)、0.1 mol/L HCl(30 min)、純水(5 min)、甲醇(30 min)沖洗，以充分暴露毛細(xì)管內(nèi)壁硅羥基，80 ℃干燥過夜后備用。P-fSiO2開管柱的制備：P-fSiO2開管柱的制備原理主要是利用P-fSiO2與負(fù)電性的石英毛細(xì)管壁之間的靜電吸附(Electrostatic Attraction)作用。過程如下：2.0%P-fSiO2乙醇溶液以5.0 μL/min灌入活化干燥后的毛細(xì)管，持續(xù)5 min，70 ℃干燥12 h后，用純水洗滌5 min，70 ℃干燥6 h得到P-fSiO2開管柱，備用。

1.4 毛細(xì)管電色譜條件

CE-1000毛細(xì)管電泳儀(Unimicro(Shanghai)Technologies,Shanghai,China)，由毛細(xì)管柱上檢測器、高壓電源及色譜工作站(Trisep-2003)組成；色譜柱：P-fSiO2開管柱(50 μm i.d，有效長度45 cm，總長度65 cm)；流動相：硼砂體系；進(jìn)樣量：電動進(jìn)樣10 kV、5 s；檢測波長：254 nm；溫度：25 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜材料和開管柱的表征

透射電子顯微鏡(TEM)顯示合成的P-fSiO2納米材料為350 nm，如圖3a所示。等溫吸脫附線是研究多孔材料表面和孔的基本數(shù)據(jù)。如圖3b所示，根據(jù)IUPAC分類的6種吸脫附等溫線，該材料的N2吸附-脫附等溫線屬于“Ⅳ”型，脫附等溫線在吸附等溫線的上方，根據(jù)介孔回滯環(huán)的類型，為H3型遲滯環(huán)，遲滯環(huán)的存在說明材料堆積形成了介孔。對其比表面積的分析一般采用Brunauer-Emmett-Teller(BET)方法，比表面積是544.56 m2/g，孔徑分布通常采用Barrett-Joiner-Halenda(BJH)模型，計算得到的平均孔徑分布為3.41 nm。

圖3 P-fSiO2的透射電鏡(TEM)圖(a)和fSiO2的N2吸附-脫附等溫線(b)Fig.3 TEM image of P-fSiO2(a) and nitrogen adsorption-desorption isotherm of fSiO2(b)

2.2 P-fSiO2開管柱的表征

掃描電子顯微鏡(SEM)是表征毛細(xì)管內(nèi)壁形態(tài)的有效方法，圖4a以及其局部放大圖4c顯示，空管的內(nèi)壁形態(tài)光滑、無涂覆跡象；而P-fSiO2開管柱的SEM圖(圖4b、4d)，顯示有一層明顯的顆粒狀固定相的存在，局部放大(圖4d)顯示填料的粒徑大小同圖3a。

圖4 空管(a)、P-fSiO2開管柱(b)的掃描電鏡(SEM)以及局部放大(c、d)圖Fig.4 SEM images of bare capillary(a),P-fSiO2 column(b) and magnified SEM(c,d)

2.3 P-fSiO2開管電色譜柱的性能評價

2.3.1 電滲流的考察在電色譜技術(shù)中，電滲流(EOF)作為流動相的主要驅(qū)動力，其大小直接影響色譜分離效果。本實驗以二甲基亞砜(DMSO)為電滲流標(biāo)記物，如圖5所示，P-fSiO2開管柱的電滲流隨pH值的降低而減小，且在相應(yīng)pH點(diǎn)的電滲流值均小于毛細(xì)管空管，尤其是在堿性pH條件下，電滲流值顯著降低。因此，基于P-fSiO2涂層材料對電滲流的抑制作用，或許可以在堿性樣品的分離分析中得到良好的應(yīng)用，接下來本文選取磺胺類堿性化合物作為P-fSiO2開管柱性能考察的標(biāo)的物。

圖5 緩沖液pH對空管和P-fSiO2開管柱的電滲流的影響Fig.5 Effect of buffer pH on EOF of bare capillary and P-fSiO2 open-tubular columnconditions:bare capillary and P-fSiO2 column(50 μm i.d.,65/45);running buffer:30 mmol/L sodium borate,pH=4.0 - 9.0;voltage:-18 kV;temperature:25 ℃;sample,DMSO;detection:220 nm.

2.3.2 緩沖鹽及濃度的考察在考察電滲流的大小及方向的基礎(chǔ)上，本文首先考察了磷酸鹽和硼砂緩沖溶液等不同體系的影響。結(jié)果表明，在磷酸鹽緩沖體系中，基線不穩(wěn)定；且同等濃度的緩沖鹽，硼砂的離子強(qiáng)度小，有利于避免較大焦耳熱的產(chǎn)生。綜合考慮，選擇硼砂緩沖溶液作為運(yùn)行緩沖液。隨著硼砂緩沖鹽濃度的增加，雙電層厚度增加，電滲流降低，帶電溶質(zhì)在開管柱內(nèi)的遷移速率變慢，同時較大的離子強(qiáng)度增大了焦耳熱，不僅影響基線的穩(wěn)定而且影響實驗的重復(fù)性。實驗考察了不同濃度緩沖溶液(25～40 mmol/L)的影響(圖6)。當(dāng)緩沖液濃度為40 mmol/L時，緩沖液離子強(qiáng)度大，表觀電流顯著增大，焦耳熱增大，溶質(zhì)擴(kuò)散加劇，峰形展寬；當(dāng)使用較低濃度緩沖液(25 mmol/L)時，遷移時間雖然較快，但峰高響應(yīng)有所降低，檢出靈敏度有所下降。綜合考慮，實驗優(yōu)化的硼砂緩沖液濃度為30 mmol/L。

2.3.3 分離電壓的考察分離電壓主要影響分析時間與分離效果兩個方面。在30 mmol/L硼砂緩沖體系下，經(jīng)過實驗考察(圖7)，當(dāng)分離電壓低于16 kV時，分離度增加，但分析時間稍長。當(dāng)電壓高于20 kV時，分析時間縮短，但分離度變差，并且此時由于焦耳熱效應(yīng)明顯，基線波動較大，使整個檢測體系較不穩(wěn)定。因此，綜合分離度、分析時間和緩沖體系穩(wěn)定性等多方面的影響，實驗選擇的分離電壓為16～20 kV之間。

圖6 緩沖液濃度對P-fSiO2開管柱分離效果的影響Fig.6 Effect of buffer concentration on the seperation efficiency of OTCEC on P-fSiO2 open-tubular columnconditions:P-fSiO2 column(50 μm i.d.,65/45);running buffer:25 - 40 mmol/L sodium borate,pH=9.0;voltage:-15 kV;temperature:25 ℃;detection:254 nm.peak identification:1.SP;2.SM2;3.SDM;4.SQX;5.SMP;6.SMM;7.SIZ;8.SD.

圖7 電壓對P-fSiO2開管柱分離效果的影響Fig.7 Effect of high voltage on the seperation efficiency of OTCEC on P-fSiO2 open-tubular columnconditions:P-fSiO2 column(50 μm i.d.,65/45);running buffer:30 mmol/L sodium borate,pH 9.0;voltage:12 - 20 kV;temperature:25 ℃;detection:254 nm;peak identification.1.SP;2.SM2;3.SDM;4.SQX;5.SMP;6.SMM;7.SIZ;8.SD.

2.3.4 緩沖液pH的考察在不同的pH環(huán)境中，因分子解離程度的不同會造成待測物的電泳速率的差異，因此緩沖液的pH是分離過程中的重要考察因素?；前奉惢衔锖谢酋０坊桶被葔A性基團(tuán)，大部分pKa在5～8之間(pKa：SP,8.4；SM2,6.05；SDM,6.8；SQX,5.5；SMP,7.2；SMM,6.05；SIZ,4.83；SD,6.5)。在優(yōu)化的條件(30 mmol/L硼砂緩沖液，16 kV)和預(yù)實驗基礎(chǔ)上，本文選取了7.0、8.0以及9.0三個點(diǎn)考察pH對磺胺分離的影響。如圖8所示，與pH=8.0的緩沖液相比，當(dāng)緩沖液pH=7.0時，雖然峰1與8的分離度變大，但是分離時間稍長(～60 min)，且峰4～6的分離度變差，峰7出現(xiàn)了前移的現(xiàn)象；當(dāng)緩沖液pH=9.0時，分離時間雖有所縮短，但峰1～8整體的分離度變小。因此，實驗選取緩沖液的較佳pH條件為8.0。

2.3.5 與空管比較在優(yōu)化的分離條件下(30 mmol/L硼砂緩沖液，18 kV，pH=8.0)，實驗比較了P-fSiO2開管柱與空管的分離能力。如圖9所示，沒有涂層的毛細(xì)管柱(即電泳模式)雖然出峰較快(時間為9～11 min)，但很難實現(xiàn)對8種磺胺的分離；而同樣的實驗條件下，P-fSiO2開管柱(即電色譜模式)由于涂層材料的存在，不僅可以實現(xiàn)對8種磺胺的良好分離(出峰時間為14～31 min)，而且SQX的柱效高達(dá)228 542N/m(表1)。我們推測，在P-fSiO2開管電色譜分離模式中，胺基聚合物材料的存在，對磺胺可能展現(xiàn)了一定的氫鍵和疏水性作用。

表1 8種磺胺的柱效數(shù)據(jù)

2.3.6 重復(fù)性在相同條件下，將同一根柱子在1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，計算出峰時間的日內(nèi)精密度(RSD%,n=6)；同一根柱子連續(xù)6 d，每天進(jìn)樣6次，計算出峰時間的日間RSD(%,n=6)；同時選取5根柱子以標(biāo)記物的出峰時間計算柱間RSD(%,n=5)，結(jié)果如表2所示。8種磺胺的日內(nèi)RSD值小于4.3%，日間RSD小于4.9%，柱間RSD為2.2%。說明，P-fSiO2開管柱具有良好的穩(wěn)定性，且對磺胺類物質(zhì)的分離具有良好的重現(xiàn)性。

圖8 緩沖液pH對P-fSiO2開管柱分離效果的影響Fig.8 Effect of buffer pH on the seperation efficiency of OTCEC on P-fSiO2 open-tubular columnconditions:P-fSiO2 column(50 μm i.d.,65/45);running buffer:30 mmol/L sodium borate,pH 7.0 - 9.0;voltage:-16 kV;temperature:25 ℃;detection:254 nm;peak identification.1.SP;2.SM2;3.SDM;4.SQX;5.SMP;6.SMM;7.SIZ;8.SD.

圖9 磺胺類化合物在P-fSiO2開管柱與空管中的分離效果Fig.9 Separation of sulfmides in P-fSiO2 open-tubular column and bare capillaryconditions:bare capillary and P-fSiO2 column(50 μm i.d.,65/45);running buffer:30 mmol/L sodium borate,pH=8.0;voltage:-18 kV;temperature:25 ℃;detection:254 nm;peak identification.1.SP;2.SM2;3.SDM;4.SQX;5.SMP;6.SMM;7.SIZ;8.SD.

表2 P-fSiO2開管柱的日內(nèi)、日間以及柱間重復(fù)性

N/A,NotApplicable.

3 結(jié)論

本文采用物理吸附的方式，將合成的P-fSiO2材料涂覆到毛細(xì)管內(nèi)壁，制備了一種新型的毛細(xì)管電色譜P-fSiO2開管柱，并將其應(yīng)用于磺胺類物質(zhì)的OT-CEC分離分析以驗證其電色譜性能。P-fSiO2開管柱的制備方法簡便、快捷、涂層穩(wěn)定。通過對緩沖溶液濃度、pH值以及分離電壓等因素的考察，可以實現(xiàn)對8種磺胺類化合物的分離，且重復(fù)性好。因此，基于P-fSiO2柱的OT-CEC方法有望在磺胺類等堿性物質(zhì)的分離分析中得到良好的應(yīng)用。