馬甜甜， 龐月紅， 錢海龍， 嚴秀平

(江南大學食品學院， 江蘇無錫 214122)

赭曲霉毒素A(OTA)是一種常見的霉菌毒素，屬2B類潛在致癌物[1]，主要污染谷物如玉米、小麥[2 - 4]以及谷物的釀造制品如啤酒、白酒[6，7]和醋等。歐盟委員會(EC No.123/2005)限定在谷物和酒類中赭曲霉毒素A的最高含量分別為5 μg·kg-1和2 μg·kg-1[8]。目前測定赭曲霉毒素A通常采用免疫親和柱進行凈化和富集，其選擇性好、回收率高，但價格昂貴、抗體不易保存[9]。因此，開發(fā)穩(wěn)定耐用、操作簡便的預富集方法具有重要的意義。

磁固相萃取(MSPE)可在外部磁場下實現(xiàn)快速分離，操作簡便，且目標物與吸附劑充分接觸，縮短富集時間。而在磁性粒子表面進行不同的功能化修飾，可制備滿足不同需要的吸附劑。共價有機骨架材料(COFs)是一類由輕質元素通過共價鍵連接的多孔材料，其比表面積大、化學穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性高、孔徑可修飾[10]等特點使其在樣品預處理[11，12]領域具有很好的應用潛力。本研究合成了Fe3O4@TpBD，建立了基于Fe3O4@TpBD的MSPE方法，并應用于高效液相色譜(HPLC)測定啤酒、白酒和醋中赭曲霉毒素A。

1 實驗部分

1.1 儀器

JEM-2100透射電鏡(TEM)(日本，電子株式會社)；D2 PHASER X射線衍射儀(XRD)(德國，BRUKER AXS GMBH)；IS10 FT-IR傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜儀(美國，Nicolet)；MPMS3振動樣品磁強計(VSM)(美國，Quantum Design)；Nano-ZES Zeta電位分析儀(英國，Malvern)；Autosorb-iQ全自動比表面和孔徑分布分析儀(美國，Quantachrome)。配備2475熒光檢測器的Waters e2695高效液相色譜儀，色譜柱為XBridge?C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(美國，Waters)。分離條件：流動相：A：乙腈，B：2%乙酸水溶液；A∶B=50∶50(V/V)，等度洗脫，流速1 mL·min-1，進樣體積10 μL。熒光檢測器條件：激發(fā)波長333 nm，發(fā)射波長460 nm。

1.2 試劑與材料

赭曲霉毒素A標準品(青島普瑞邦生物工程有限公司)。100 μg·mL-1的赭曲霉毒素A儲備溶液由甲醇配制并儲存于-20 ℃。250 μg·L-1的赭曲霉毒素A標準溶液由儲備溶液使用甲醇逐級稀釋制備。5 μg·L-1的工作溶液采用超純水定容制備。1,3,5-三甲基間苯三酚(Tp)(成都同創(chuàng)源醫(yī)藥科技有限公司)；聯(lián)苯胺(BD)、均三甲苯、硅酸四乙酯(TEOS)、聚苯乙烯磺酸鈉-馬來酸共聚物(PSSMA 3∶1，Mw 20 000)和3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)(中國上海阿拉丁生化科技有限公司)；甲酸、冰乙酸、乙二醇、氫氧化銨、FeCl3·6H2O、1,4-二氧六環(huán)、乙醇和N，N-二甲基甲酰胺(中國上海國藥集團化學試劑有限公司)；甲醇和乙腈均為色譜純(中國賽默飛世爾科技有限公司)；超純水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

1.3 Fe3O4@TpBD的制備

Fe3O4納米粒子參考文獻方法[13]合成。對Fe3O4納米粒子進行氨基化：將150 mg Fe3O4納米粒子分散在100 mL乙醇中并超聲處理30 min，在機械攪拌下加入25 mL水和1.2 mL氫氧化銨溶液，然后將含100 μL TEOS的5 mL乙醇溶液加入體系中反應9 h。用磁鐵收集深色產(chǎn)物，并用乙醇和水各洗滌3次。將得到的產(chǎn)物分散在120 mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入0.5 mL APTES，在80 ℃水浴條件下攪拌9 h，分離產(chǎn)物并用乙醇和水洗滌，在真空干燥箱中干燥過夜。TpBD包裹Fe3O4納米粒子參考Li等[14]的方法合成。其制備流程如圖1所示。

圖1 (A)Fe3O4@TpBD的制備流程圖；(B)磁固相萃取流程圖Fig.1 (A) Schematic illustration for fabricating Fe3O4@TpBD；(B) Schematic illustration for magnetic solid-phase extraction

1.4 樣品采集與制備

樣品白酒和醋購買于當?shù)爻?，啤酒樣品購買于超市和燒烤攤。啤酒樣品使用前超聲30 min以除去CO2。醋樣品直接用于磁固相萃取。白酒樣品萃取時在4 mL白酒中加入1 mL超純水進行實驗。

1.5 磁固相萃取過程

準確稱取5 mg Fe3O4@TpBD復合材料，置于5 mL 5 μg·L-1的赭曲霉毒素A溶液中5 min進行萃取，使用磁鐵分離復合材料與溶液，之后棄去上清液，復合材料使用甲醇∶乙腈∶甲酸∶水(40∶50∶5∶5，V/V/V/V)的洗脫劑500 μL，超聲處理3 min進行洗脫，并重復一次洗脫步驟，合并兩次洗脫液(1 mL)，使用0.22 μm的尼龍濾膜過濾后，用于高效液相色譜進行定量分析。

2 結果與討論

2.1 Fe3O4@TpBD表征

對所合成的Fe3O4納米粒子、TpBD以及Fe3O4@TpBD進行XRD以及FT-IR光譜表征，結果與文獻一致[14]，表明TpBD在Fe3O4納米粒子上成功生長。VSM證明復合材料Fe3O4@TpBD的磁化飽和度值為37.4 emu·g-1，能夠在外加磁場下快速與溶液分離。

對所合成Fe3O4納米粒子和Fe3O4@TpBD的形貌進行表征。如圖2(a)和2(b)，與裸Fe3O4納米粒子相比，F(xiàn)e3O4@TpBD表面明顯包覆一層材料，形成核-殼結構，包裹材料厚度約為40 nm。Fe3O4、TpBD和Fe3O4@TpBD的N2吸附-解吸等溫線如圖2(c)所示，其BET比表面積分別為56.7 m2·g-1、888.4 m2·g-1和447.8 m2·g-1，表明Fe3O4經(jīng)與TpBD材料復合后，比表面積明顯增加。

圖2 (a)Fe3O4和(b)Fe3O4@TpBD的透射電鏡圖；(c)Fe3O4、TpBD和Fe3O4@TpBD的N2吸附-解吸等溫線Fig.2 TEM images:(a) Fe3O4;(b) Fe3O4@TpBD.(c) Nitrogen adsorption-desorption isotherms of Fe3O4,TpBD and Fe3O4@TpBD

2.2 富集條件優(yōu)化

2.2.1 吸附劑用量實驗表明(圖3(a))，2 mg吸附劑即可滿足要求，但考慮到2 mg測定實際樣品時可能存在雜質與目標物競爭吸附，實驗選擇5 mg吸附劑。

2.2.2 萃取時間在2～20 min范圍內考察萃取時間(圖3(b))。在考察范圍內，赭曲霉毒素A峰面積無明顯變化，表明Fe3O4@TpBD可在較短的時間完成對目標物的富集，故萃取時間選擇5 min。

2.2.3 鹽濃度鹽濃度的增加對萃取效率并無明顯影響(圖3(c))。實驗選用不添加鹽。

2.2.4 溶液pH在pH=3～10的范圍內考察溶液pH對萃取效率的影響(圖3(d))。隨著pH值的升高，萃取效率有微弱的增加趨勢?？赡苁且驗轸髑苟舅谹在酸性條件下易與H+形成分子間氫鍵，從而導致萃取效率較低。在實驗中考慮操作的簡便性，選擇pH為6。

2.2.5 解吸溶劑考察不同溶劑對赭曲霉毒素A的洗脫性能(圖3(e))。實驗選用洗脫效果最好的甲醇∶乙腈∶甲酸∶水(40∶50∶5∶5，V/V/V/V)混合溶劑作為解吸溶劑。

2.2.6 解吸溶劑體積考察不同解吸溶劑體積的洗脫效果(圖3(f))。當洗脫體積較小時易造成誤差，以及少量多次更有利于充分洗脫，實驗選擇0.5 mL解吸溶劑，洗脫2次用于后續(xù)實驗。

圖3 萃取和洗脫條件的優(yōu)化Fig.3 Optimization of extraction and elution conditions

圖4 Fe3O4@TpBD復合材料的循環(huán)使用次數(shù)Fig.4 Cycles times used of Fe3O4@TpBD

2.3 Fe3O4@TpBD復合材料的重復使用性

為評價Fe3O4@TpBD的重復使用性，在MSPE后，將Fe3O4@TpBD用1 mL甲醇∶乙腈∶甲酸∶水(40∶50∶5∶5，V/V/V/V)超聲洗脫3 min，重復3次，干燥后用于下次實驗。在優(yōu)化條件下使用5 mg Fe3O4@TpBD對5 mL 5 μg·L-1的赭曲霉毒素A標準溶液進行富集，經(jīng)過7次吸附-解吸后Fe3O4@TpBD復合材料的萃取效率仍可保持在85.5%以上(圖4)。

2.4 方法分析特性

所建立方法的分析特性見表1，線性范圍為0.2～50.0 μg·L-1，相關系數(shù)為0.9999，檢出限(S/N=3)為0.05 μg·L-1，定量限(S/N=10)為0.17 μg·L-1。

表1 Fe3O4@TpBD萃取赭曲霉毒素A的分析特性

2.5 實際樣品分析

將所建立方法應用于2種啤酒、2種白酒和2種醋樣品中赭曲霉毒素A的分析。啤酒樣品1、白酒樣品和醋樣品中均未檢測到赭曲霉毒素A，啤酒樣品2中赭曲霉毒素A含量為0.46 μg·L-1，加標回收率為82.2%～106.1%，標準偏差小于7.2%(表2)。方法可應用于實際樣品中赭曲霉毒素A的測定。

表2 實際樣品以及加標樣品中赭曲霉毒素A的分析結果(平均值±標準偏差，n=6)

aND:not detected.

2.6 方法比較

如表3所示，與其它文獻方法比較，所建立的方法具有較低的檢出限，且能夠在實際加標樣品測定中實現(xiàn)定量回收。

表3 赭曲霉毒素A的富集檢測方法比較

aSWCNHs:single-walled carbon nanohorns.

3 結論

采用共價鍵合的方法將共價有機骨架材料TpBD修飾到Fe3O4納米粒子表面，制備了Fe3O4@TpBD復合材料。該復合材料具有比表面積大、穩(wěn)定性高以及重復性好的優(yōu)點。將Fe3O4@TpBD復合材料作為磁性吸附劑，并與高效液相色譜聯(lián)用，建立了赭曲霉毒素A的分析新方法。該方法檢出限低、重復性好，并成功應用于食品樣品中的赭曲霉毒素A的測定。