王緒山，王敏，李靜，陳開勇(灌云縣人民醫(yī)院檢驗科，江蘇灌云222200)

慢性炎癥是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)重要的發(fā)病機(jī)制，關(guān)節(jié)腔中浸潤大量單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞，導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)腔滑膜異常增生、軟骨和骨質(zhì)破壞[1]?；诩?xì)胞表面CD14和CD16的表達(dá)情況，人類單核細(xì)胞可分為CD14++CD16-經(jīng)典型、CD14+CD16+中間型和CD14lowCD16++非經(jīng)典型，中間型和非經(jīng)典型亞群被認(rèn)為在RA等多種炎癥、自身免疫病中發(fā)揮重要作用[2-3]。單核細(xì)胞表面表達(dá)Toll樣受體9(Toll like receptor-9，TLR9)，通過識別細(xì)菌/病毒等DNA的非甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CPG)、真核細(xì)胞線粒體DNA等配體，誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌炎性因子和趨化因子，發(fā)揮固有免疫應(yīng)答的作用[4]。但TLR9在單核細(xì)胞亞群中的表達(dá)及其在RA疾病中的作用目前尚不明確。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測RA患者外周血單核細(xì)胞TLR9表達(dá)，并通過非甲基化CPG活化TLR9，分析單核細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子的變化，探討單核細(xì)胞TLR9在RA疾病中的作用。

1 材料與方法

1.1研究對象 選擇2018年1月—2019年2月在灌云縣人民醫(yī)院骨科就診的活動性中重度RA患者32例，作為RA組，年齡(48.7±12.5)歲，男6例，女26例；納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2010年美國風(fēng)濕病學(xué)會/歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟分類標(biāo)準(zhǔn)，未接受甲氨蝶呤或生物制劑治療，DAS28-ESR疾病活動評分≥3.2分，3.2分0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號2017-04)，參加者知情同意。

1.2儀器和試劑 Calibur流式細(xì)胞分析儀(美國BD公司)，Luminex 200液相芯片檢測系統(tǒng)(R&D公司)，特定蛋白儀(德靈公司)；異硫氰酸熒光素(FITC)-鼠抗人CD14單克隆抗體(mAb)、別藻青蛋白(APC)-鼠抗人TLR9 mAb、percpcy5.5-鼠抗人CD16 mAb及同型對照和紅細(xì)胞裂解液(BD Biosciences公司)，F(xiàn)icoll-HyPaque分離液(上海西糖生物公司)，RPMI-1640完全培養(yǎng)液(美國Gibco公司)，非甲基化全鏈硫代修飾CpG-ODN 2006(上海生工公司)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1和白細(xì)胞介素(IL)-6檢測試劑(美國Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 在空腹?fàn)顟B(tài)下抽取健康人對照者和RA患者靜脈血6 mL置于肝素鈉抗凝管中，其中1 mL用于流式細(xì)胞檢測，其余5 mL用于分離單核細(xì)胞。RA患者有9例有關(guān)節(jié)腔積液，治療前抽取積液4 mL，采用Ficoll密度梯度法分離積液單個核細(xì)胞，并用500 μL PBS重懸，用于流式細(xì)胞分析。

1.3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測單核細(xì)胞亞群及其表面TLR9 取肝素抗凝靜脈血100 μL或PBS重懸的關(guān)節(jié)腔積液單個核細(xì)胞100 μL，加入10 μL FITC-鼠抗人CD14 mAb、10 μL percpcy5.5-鼠抗人CD16 mAb，避光反應(yīng)30 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入0.1%皂素500 μL破膜20 min。1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入10 μL APC-鼠抗人TLR9 mAb，避光反應(yīng)30 min，然后加入500 μL紅細(xì)胞裂解液，避光反應(yīng)8 min，PBS洗滌后用400 μL PBS重懸，上流式分析儀檢測。根據(jù)前向散射光和側(cè)向散射光，外周血以單核細(xì)胞設(shè)門(關(guān)節(jié)液中細(xì)胞分散，以所有的細(xì)胞設(shè)門)，檢測CD14++CD16-經(jīng)典型、CD14+CD16+中間型和CD14lowCD16++非經(jīng)典型細(xì)胞比例，并檢測各亞群細(xì)胞表面TLR9平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)。

1.3.3單核細(xì)胞分離和培養(yǎng) 采用Ficoll密度梯度法分離來自健康人志愿者和RA患者的外周血單個核細(xì)胞，用RPMI-1640完全培養(yǎng)液(含10%小牛血清、100 U/L鏈霉素、100 U/L青霉素)重懸，在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中貼壁2 h后，去除非貼壁細(xì)胞，加入RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集單核細(xì)胞，取100 μL單核細(xì)胞，加入10 μL FITC-鼠抗人CD14 mAb，避光反應(yīng)20 min，PBS洗滌后用400 μL PBS重懸，流式分析儀檢測CD14陽性細(xì)胞比例，結(jié)果顯示純度>95%。

1.3.4細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、MCP-1濃度檢測 上述單核細(xì)胞經(jīng)RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104cells/mL，培養(yǎng)于24孔板，分2孔，其中1孔加入40 μg/mL CpG-ODN 2006，另1孔為空白對照,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，收集上清液，儲存于-80 ℃。用Luminex 200液相芯片檢測上清液細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、MCP-1濃度：取96孔板，每孔加50 μL交聯(lián)待檢細(xì)胞因子mAb的磁球，平放在磁鐵板上5 min后棄上清液，然后每孔加50 μL樣本和標(biāo)準(zhǔn)品，室溫下振蕩反應(yīng)30 min，棄上清液，每孔加入親和素標(biāo)記的二抗25 μL，室溫反應(yīng)30 min，最后每孔加入50 μL PE標(biāo)記的生物素，室溫靜置10 min后洗滌，Luminex 200檢測系統(tǒng)檢測樣本的熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的熒光強(qiáng)度計算各樣本細(xì)胞因子濃度。每個樣本檢測3次，取均值。IL-6、TNF-α、MCP-1檢測限分別為1.5 pg/mL、1.8 pg/mL和2.0 pg/mL。

2 結(jié)果

2.1RA患者外周血單核細(xì)胞亞群比例 以單核細(xì)胞設(shè)門(見圖1A)，根據(jù)CD14和CD16表達(dá)檢測單核細(xì)胞亞群(見圖1B)。與HC組相比，RA患者經(jīng)典型單核細(xì)胞比例顯著降低，中間型和非經(jīng)典型單核細(xì)胞比例均顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表1。

表1 外周血單核細(xì)胞亞群比例比較

2.2RA患者外周血單核細(xì)胞TLR9 MFI檢測 與HC組相比，RA患者外周血3個單核細(xì)胞亞群TLR9 MFI均顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見圖2、表2。

表2 外周血單核細(xì)胞亞群中TLR9平均熒光強(qiáng)度比較

2.3不同活動度RA患者外周血單核細(xì)胞亞群TLR9 MFI比較 高疾病活動度組與中疾病活動度組相比，單核細(xì)胞亞群TLR9 MFI表達(dá)均顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同活動度RA患者外周血單核細(xì)胞亞群TLR9 MFI

2.4RA患者關(guān)節(jié)腔積液單核細(xì)胞TLR9檢測 RA患者關(guān)節(jié)腔積液單核細(xì)胞亞群比例分別為：經(jīng)典型(60.6±9.1)%、中間型(31.1±6.4)%、非經(jīng)典型(8.7±2.3)%；TLR9 MFI分別為：經(jīng)典型309.6±32.4、中間型461.2±26.5、非經(jīng)典型288.5±25.4。

2.5CPG活化的外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子檢測 與HC組活化后相比，RA患者組活化后上清液細(xì)胞因子濃度均顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與活化前相比，HC和RA組活化后上清液細(xì)胞因子濃度均顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 CPG活化的單核細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子水平(pg/mL)

3 討論

人類單核細(xì)胞CD14++CD16-經(jīng)典型可產(chǎn)生高水平的活性氧(ROS)、IL-6和IL-8，迅速募集到炎癥部位，吞噬清除病原體[6]；CD14+CD16+中間型高表達(dá)HLA-DR，產(chǎn)生更高水平的活性氮物質(zhì)(RNS)、IL-1β和TNF-α；而CD14dimCD16+非經(jīng)典型參與巡邏血管內(nèi)皮細(xì)胞對病毒和免疫復(fù)合物的反應(yīng)[7]。早期研究表明RA患者外周血中CD14dimCD16+非經(jīng)典型單核細(xì)胞增加[8]，而最近研究表明外周血中CD14+CD16+中間型亞群的頻率增加[9-10]，且與疾病的嚴(yán)重程度顯著相關(guān)。本研究結(jié)果表明RA患者外周血經(jīng)典型亞群顯著降低，中間型和非經(jīng)典型顯著上升。本研究還發(fā)現(xiàn)RA患者關(guān)節(jié)腔積液中存在較多的單核細(xì)胞，且中間型亞群比例高于外周血，表明這些細(xì)胞不斷向炎癥組織募集，參與參與關(guān)節(jié)腔炎癥反應(yīng)。

Kyburz等[11]研究表明TLR9信號傳導(dǎo)抑制劑羥氯喹可抑制RA炎癥的嚴(yán)重程度，其顯著的治療效果表明TLR9參與RA疾病過程。本研究在外周血和關(guān)節(jié)腔積液3個單核細(xì)胞亞群中均檢測到TLR9的高表達(dá)，且高疾病活動度患者TLR9表達(dá)更顯著，突顯了單核細(xì)胞TLR9在RA疾病中的潛在作用。

RA患者血液中死亡細(xì)胞釋放的含有非甲基化CpG重復(fù)序列的線粒體DNA、細(xì)菌/病毒等病原體DNA的非甲基化的CpG寡核苷酸均可作為TLR9內(nèi)源性配體，活化激活絲裂原活化蛋白激酶p38和NF-κB信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞的固有免疫應(yīng)答[12]。本研究證實(shí)，單核細(xì)胞經(jīng)TLR9配體CpG-ODN 2006刺激后可分泌高濃度的IL-6、TNF-α和MCP-1。促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α可刺激軟骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮、淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的活化，從而直接介導(dǎo)滑膜增殖和損傷，并產(chǎn)生降解關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，導(dǎo)致RA中的骨吸收[13]。MCP-1是一種高效的趨化因子，參與炎癥單核細(xì)胞的募集。以上結(jié)果表明，RA患者單核細(xì)胞高水平的TLR9參與促炎細(xì)胞因子或趨化因子IL-6、TNF-α和MCP-1的產(chǎn)生，參加RA疾病發(fā)展。

綜上所述，活動性RA患者關(guān)節(jié)腔積液中存在高比例的中間型和非經(jīng)典型單核細(xì)胞。另外，RA患者外周血單核細(xì)胞3個亞群均具有高水平的TLR9，TLR9激動劑增加炎性細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。因此，單核細(xì)胞TLR9在RA患者的疾病過程中發(fā)揮重要作用。本研究的局限性是對總體細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌進(jìn)行檢測，未對單核細(xì)胞亞群進(jìn)行分選，分析亞群中的功能。因此，單核細(xì)胞亞群TLR9在RA疾病中的作用需要進(jìn)一步深入研究。