石玉如，常文嬌，岳莉，劉婷，劉佳星，劉楊，谷妍，王云，戚應杰(中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院感染病院檢驗科，合肥30000；中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，合肥3000)

新型冠狀病毒核酸檢測作為早診斷、早治療、早隔離的依據(jù)，一直受到臨床治療及防疫一線醫(yī)務人員的重視。核酸檢測結果是確診2019冠狀病毒病(corona virus disease 2019, COVID-19)的關鍵，但由于目前沒有定量的試劑，無法評價病毒在體內復制情況。循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct值)是每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環(huán)次數(shù)，是一個半定量的數(shù)值，與體內的病毒載量呈負相關，Ct值越低，說明標本中病毒載量越高[1]。本研究擬探討COVID-19患者核酸檢測Ct值的變化規(guī)律。

1 資料和方法

1.1一般資料 篩選中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院感染病院2020年1月21日至3月2日收治的45例COVID-19患者。其中，男性24例，女性21例，年齡4～91歲。COVID-2019的診斷標準和臨床分型方法參照根據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會頒布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》。根據(jù)患者病情嚴重程度，分為輕型5例(占11.11%)、普通型28例(62.22%)、重型10例(22.22%)、危重型2例(4.44%)。所有研究對象的咽拭子及痰液混合液新型冠狀病毒核酸檢測均為陽性。本研究為回顧性研究，所有臨床資料均為正常診療活動中的檢查項目，提取數(shù)據(jù)僅限于患者性別、年齡及臨床診療資料，對于姓名、家庭住址等資料無任何涉及。研究經過中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準[文件編號：2020-XG(H)-001)]。

1.2主要儀器與試劑 全自動RNA提取儀(江蘇碩世公司)，SLAN-96P實時熒光定量PCR儀(上海宏石公司)；病毒RNA提取試劑盒、實時熒光逆轉錄PCR試劑(江蘇碩世公司)。

1.3樣本采集及處理 患者出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、胸悶等癥狀時，每隔6天采集患者痰及咽拭子標本，直至患者核酸檢測轉陰，最長監(jiān)測34 d。痰及咽拭子標本于65 ℃ 30 min滅活后充分振蕩混勻。

1.4實時熒光RT-PCR 取200 μL混合樣本加入提取試劑盒，在全自動RNA病毒核酸提取儀上進行提取。在實時熒光PCR儀上機進行實時熒光RT-PCR擴增檢測，嚴格按照試劑說明書進行。循環(huán)參數(shù)：50 ℃逆轉錄30 min，1個循環(huán)；95 ℃預變性5 min，1個循環(huán)；95 ℃變性10 s，55 ℃40 s退火、延伸，45個循環(huán)；55 ℃檢測熒光信號。FAM通道檢測開放閱讀框(ORF1ab)基因，VIC通道檢測包膜蛋白基因E，ROX通道檢測核殼蛋白基因N。結果判讀：新型冠狀病毒核酸Ct陽性閾值為38，3840均記錄為40。

1.5統(tǒng)計學分析 用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件及Graphpad Prism 5進行統(tǒng)計學分析及圖形繪制。非正態(tài)分布的計量資料用四分位數(shù)表示，兩組資料比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多組樣本間的比較采用Kruskal-WallisH檢驗，Spearman等級相關系數(shù)用于兩組連續(xù)變量之間的線性相關分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1核酸Ct值隨發(fā)病天數(shù)變化情況 隨著發(fā)病天數(shù)的增加，ORF1ab、N、E基因的Ct值不斷增高。E基因首先轉陰性、N基因最后轉為陰性。見表1。

表1 Ct值隨時間變化情況

2.2核酸Ct值與性別的關系 從出現(xiàn)癥狀之日起至第6天，此時男性與女性的核酸Ct值最低，男性、女性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；從出現(xiàn)癥狀第7天至第12天Ct值逐漸升高，但此時男性Ct值低于女性，差異有統(tǒng)計學意義(ORF1ab：Z=2.238；N基因：Z=2.446；E基因：Z=1.985，P均<0.05)；13 d后男性與女性Ct值均不斷升高，男性、女性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同性別間Ct值的比較

2.3核酸Ct值與年齡的關系 各年齡組間ORF1ab、N、E基因Ct值差異無統(tǒng)計學意義(ORF1ab：P=0.675；N基因：P=0.660；E基因：P=0.838)。見表3。

表3 不同年齡組Ct值的比較

2.4Ct值與疾病分型的關系 33例輕型/普通型患者和12例重型/危重型患者間ORF1ab基因、N基因、E基因Ct值差異無統(tǒng)計學意義。見表4。

表4 Ct值與疾病分型的關系

3 討論

引起此次新型冠狀病毒肺炎疫情的是一種β屬冠病毒(SARS-CoV-2)，直徑60～140 nm，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，常為多形性[2]。目前采用的實時熒光RT-PCR技術以ORF1ab基因、N基因以及E基因作為檢測靶標。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨時間的增加，患者Ct值不斷增加，E基因最先消失，其次是ORF1ab基因，最后是N基因，所以不能以E基因作為患者轉陰的標準，否則可能造成假陰性結果。有研究指出，在細胞中新型冠狀病毒的mRNA數(shù)倍于病毒的基因組RNA，且將轉錄出不同長度的mRNA，這些mRNA都帶有N 基因，而只有少數(shù)帶有ORF1ab；試劑盒的檢測多為細胞內的病毒mRNA，因此患者樣本中N基因mRNA的拷貝數(shù)遠高于ORF1ab基因，故在新型冠狀病毒拷貝數(shù)較低的情況下，N基因檢測單通道陽性的比例較高[3]，N基因也是最后消失的基因。

研究顯示，在出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、胸悶等癥狀起至第6天這段時間，Ct值最低，此時進行核酸檢測為最佳檢測時期。隨著時間的推移，在第7天至第12天，男性核酸Ct值低于女性，女性體內病毒核酸水平比男性下降得快。Xiong等[4]研究團隊認為，女性免疫力要高于男性?？赡苷怯捎谂跃哂懈哂谀行缘拿庖吡Γ钟扒宄滦凸跔畈《镜哪芰σ哂谀行?。同時發(fā)現(xiàn)不同年齡組Ct值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與曾希鵬等[5]研究結果一致，可能是由于病毒載量反映病毒在體內的復制情況，不同年齡組對SARS-CoV-2在體內復制的情況基本一致。同時對輕/普通型、重/危重型患者進行Ct值檢測，未發(fā)現(xiàn)疾病分型與Ct值有關，與劉映霞等[6]報道不一致，可能與不同研究者所選取的病例處于起病的不同階段有關，本文對患者全程進行監(jiān)測。

綜上所述，Ct值隨發(fā)病天數(shù)增加而增高，最佳檢測時間為出現(xiàn)癥狀后的1～6 d，女性在7～12 d Ct值明顯上升，患者病情逐漸恢復。E基因最先消失，不能以E基因的消失判斷患者是否轉陰，患者的疾病分型、年齡與Ct值無關。