郄春花，劉亞敏，李穎，王玥，吳紅章，孟超(天津市第二人民醫(yī)院 .檢驗科,.感染科，天津300192)

百日咳是百日咳鮑特菌(Bordetellapertussis，Bp)感染引起的一種嚴(yán)重的急性呼吸道傳染病。鮑特菌家族成員還包括副百日咳鮑特菌(Bordetellaparapertussis，Bpp)、支氣管敗血鮑特菌(Bordetellabronchiseptica，Bb)和霍氏鮑特菌(Bordetellaholmesii，Bh)等。目前Bp的實驗室診斷主要依靠細(xì)菌培養(yǎng)、鼻咽拭子PCR檢測[1]。傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)后生化鑒定方法操作繁瑣、耗時長。鼻咽拭子PCR檢測靈敏度高，但容易產(chǎn)生假陽性?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)技術(shù)通過將待測微生物的特征蛋白質(zhì)指紋圖譜與已知微生物的特征蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫比對,實現(xiàn)微生物的鑒定，可彌補生化反應(yīng)耗時長的缺點。Bruker數(shù)據(jù)庫包含10株Bp、11株Bpp和9株Bb等譜圖信息，其他品牌質(zhì)譜儀譜庫尚未列入Bp譜圖信息。由于菌株的地區(qū)差異較大，現(xiàn)有的質(zhì)譜庫并不能滿足地方流行株的準(zhǔn)確鑒定需求。本研究以本地區(qū)臨床分離Bp進(jìn)行質(zhì)譜庫的擴(kuò)充以提升地方分離株的鑒定能力。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集天津市第二人民醫(yī)院2018年3月至2019年8月自門診和住院患兒(0～6個月)鼻咽拭子或呼吸道抽吸物培養(yǎng)分離獲得的45株Bp和1株Bpp，挑取其中10株(9株Bp和1株Bpp)用于現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫的擴(kuò)展，其余36株用于驗證Bruker蛋白質(zhì)指紋譜庫擴(kuò)展后的鑒定效果。所有菌株的最初鑒定采用Bruker公司的MALDI-TOF MS質(zhì)譜技術(shù)，并經(jīng)全基因組測序驗證。金黃色葡萄球菌ATCC 29213、大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 700603、銅綠假單胞菌ATCC 27853來自天津市臨床檢驗中心。

1.2主要試劑與儀器 炭瓊脂粉(英國Oxiod公司)，血瓊脂平板(天津金章科技公司)，甲酸和乙腈(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)，QIAamp DNA Mini Kit(美國Qiagen公司)；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀、HCCA基質(zhì)及質(zhì)譜鑒定校準(zhǔn)品BTS(德國Bruker公司)，高通量基因測序儀BGISEQ-500及高通量測序套裝PE50(華大智造科技公司)。

1.3菌株分離培養(yǎng)及鑒定 所有菌株初代培養(yǎng)用炭瓊脂培養(yǎng)基，挑取單個菌落轉(zhuǎn)種于血瓊脂平板。菌種經(jīng)MALDI-TOF MS初步鑒定后，用QIAamp DNA Mini Kit提取全基因組DNA，應(yīng)用超聲波將DNA片段化后用于文庫制備。單鏈環(huán)狀DNA分子通過滾環(huán)復(fù)制，形成1個包含300多個拷貝的DNA納米球。將得到的DNA納米球采用高密度DNA納米芯片技術(shù)，加到芯片的網(wǎng)狀小孔內(nèi)，通過聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)進(jìn)行測序[2]。全基因測序工作委托深圳華大基因公司完成。原始數(shù)據(jù)應(yīng)用生物信息分析軟件MegaBOLT進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控，數(shù)據(jù)比對，變異識別，從而得到有效數(shù)據(jù)。測序讀長300 bp、測序深度20倍、覆蓋度92%。測序所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中的序列比對，獲得菌株鑒定結(jié)果。

1.4數(shù)據(jù)庫擴(kuò)展 挑取1.3中9株Bp和1株Bpp，用于擴(kuò)展布魯克數(shù)據(jù)庫Taxonomy(5989)。樣品的前處理采用甲酸乙腈提取法[3]，取上清液1 μL點在96孔靶板上，室溫下晾干，再加1 μL HCCA覆蓋，室溫下晾干后上機(jī)。靶板中心點位涂布校準(zhǔn)品BTS，用于質(zhì)譜儀器的內(nèi)部校準(zhǔn)。每個樣品重復(fù)點8個樣品孔，應(yīng)用儀器Microflex LT軟件，每個靶點采集3張質(zhì)譜圖，每個菌株采集24張質(zhì)譜圖并作為質(zhì)譜文件保存。使用Biotyper 3軟件分別調(diào)入所采集的9株Bp和1株Bpp的質(zhì)譜圖，根據(jù)Bruker主譜圖(main spectral profile，MSP)創(chuàng)建要求，將同一菌株的24張質(zhì)譜圖(至少20張)匯總生成整合圖譜，創(chuàng)建為該菌株的MSP。應(yīng)用Biotyper 3軟件將質(zhì)譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)分析匯總，將創(chuàng)建的MSP導(dǎo)入布魯克數(shù)據(jù)庫Taxonomy(5989),擴(kuò)展后的數(shù)據(jù)庫命名為Taxonomy(5989+)。

1.5MALDI-TOF MS的準(zhǔn)確性、精密度評價 參考文獻(xiàn)[4]方法，對ATCC 29213、ATCC 25922、ATCC 700603、ATCC 27853各1株，進(jìn)行MALDI-TOF MS鑒定，通過獲得的鑒定結(jié)果與分值評價該方法的準(zhǔn)確性。參考文獻(xiàn)[5]方法，選取6株Bp傳代培養(yǎng)，每個菌株取3個菌落分別制備靶板，用MALDI-TOF MS鑒定，以鑒定符合率評價方法的精密度。

1.6數(shù)據(jù)庫擴(kuò)展前后菌株的鑒定 按照1.4中方法制備36株待測菌靶板，分別用Taxonomy(5989)和Taxonomy(5989+)進(jìn)行鑒定。依據(jù)Bruker儀器說明書，鑒定分值判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：分值為2.300～3.000，表示可信的種水平的鑒定；分值為2.000～2.299，表示可信的屬水平的鑒定，可能的種水平鑒定；分值為1.700～1.999，表示可能的屬水平的鑒定；分值為0.000～1.699，表示鑒定結(jié)果不可信。

2 結(jié)果

2.1全基因組測序結(jié)果 文庫構(gòu)建插入片段大小為300～400 bp，應(yīng)用MegaBOLT軟件進(jìn)行基因組的從頭組裝，最終獲得的有效數(shù)據(jù)片段大小為1 100～1 300 Mb。測序所得序列與美國國立生物技術(shù)中心(NCBI)庫中的參考序列比對，其中1株鑒定為Bpp外，其余均鑒定為Bp。

2.2MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫的擴(kuò)展 成功構(gòu)建9株Bp和1株Bpp參考譜庫，并擴(kuò)展現(xiàn)有布魯克數(shù)據(jù)庫Taxonomy(5989)數(shù)據(jù)庫為Taxonomy(5989+)。部分菌株MALDI-TOF MS質(zhì)譜峰見圖1。

2.3MALDI-TOF MS的準(zhǔn)確性和精密度 用MALDI-TOF MS鑒定4株標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29213、ATCC 25922、ATCC 700603、ATCC 27853,鑒定分值均大于2.300，對鮑特氏菌鑒定無干擾，表明試驗的準(zhǔn)確性良好。6株Bp每個菌株分別取3個菌落進(jìn)行鑒定，重復(fù)測定3次，鑒定符合率為100%，表明試驗的精密度良好。

2.4數(shù)據(jù)庫擴(kuò)展對鑒定結(jié)果的影響 36株Bp建庫前可信度分值為2.000～2.229者(準(zhǔn)確鑒定到屬)有28株，分值為1.7000～1.999者7株，無分值>2.300菌株；建庫后可信度分值>2.300者(準(zhǔn)確鑒定到種)有31株，占86.1%(31/36)，分值為2.000～2.229者(準(zhǔn)確鑒定到屬)有4株。

3 討論

菌株蛋白質(zhì)指紋圖譜信息的豐富是準(zhǔn)確鑒定菌株的基礎(chǔ)，選擇建庫的菌株必須有代表性，要囊括盡量多的型別和不同的地區(qū)分離株，尤其要包括本地區(qū)種群的菌株，以便獲得更好的匹配結(jié)果[6]。由于不同國家或地區(qū)的菌株具有一定的差異，建立適合本地區(qū)的Bp蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫具有重要意義。

本研究選取經(jīng)全基因組測序確認(rèn)的9株Bp和1株Bpp臨床分離菌株為基礎(chǔ)，建立一個與商業(yè)數(shù)據(jù)庫互補的擴(kuò)展數(shù)據(jù)庫。結(jié)果顯示，建庫前本院分離菌株的鑒定結(jié)果分值普遍偏低，建庫后菌株鑒定結(jié)果可信度分值>2.300者提升到86.1%，表明建庫后種水平鑒定結(jié)果可信度顯著增高。相似的結(jié)果與Van den Bossche等[7]研究具有一致性。

MALDI-TOF MS技術(shù)從根本上改變了目前臨床實驗室對微生物鑒定的操作模式，為微生物快速鑒定帶來了一場革命。由于Bpp、Bb等感染非常少見，本擴(kuò)展庫尚存在納入菌株種類不足等缺陷。相信隨著數(shù)據(jù)庫的不斷補充與應(yīng)用軟件的改善，MALDI-TOF MS不僅將在Bp的鑒定中體現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、高通量的特點，還會成為Bp分型和流行病學(xué)研究的有力工具。