吳艷玲，謝玉華，李升錦(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸科，重慶 400010)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的慢性傳染性疾病。結(jié)核病的確診是基于病原體的檢測(cè)，依賴于測(cè)量樣本中的病原體負(fù)荷量。由于臨床上難以獲得MTB檢測(cè)樣本，并且受樣本中MTB分布不可預(yù)測(cè)的影響，結(jié)核病的診斷顯得比較困難，尤其是肺外結(jié)核和涂片陰性的肺結(jié)核[1]。因此，探索一種高敏感性和特異性的血清學(xué)結(jié)核感染標(biāo)志物對(duì)結(jié)核病的診斷具有重要的臨床價(jià)值。

微小RNA(microRNA，miRNA)是由22～24個(gè)核苷酸組成的在翻譯水平調(diào)控真核細(xì)胞基因表達(dá)的非編碼小分子RNA，約60%的人類(lèi)轉(zhuǎn)錄基因組可能受miRNA調(diào)控[2]。目前研究認(rèn)為循環(huán)miRNA與結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系，并被證實(shí)可以作為診斷活動(dòng)性結(jié)核病的潛在生物標(biāo)志物[3]，但目前對(duì)于其診斷準(zhǔn)確性尚無(wú)統(tǒng)一結(jié)論。故本研究采用薈萃(meta)分析方法作出定量的合并，從而客觀評(píng)估循環(huán)miRNA對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病的診斷效能。

1 資料與方法

1.1資料來(lái)源 計(jì)算機(jī)檢索PubMed、Web of Science、Embase、中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)、中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(CBM)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)和維普數(shù)據(jù)庫(kù)(VIP)，搜集循環(huán)miRNA與活動(dòng)性結(jié)核病相關(guān)性的研究，檢索時(shí)間從建庫(kù)至2019年4月。此外，追溯納入研究的參考文獻(xiàn)，以補(bǔ)充獲取相關(guān)文獻(xiàn)。英文檢索詞包括：tuberculosis、mycobacterium terberculosis、Koch′s disease、microRNA、microRNAs、miRNA、miRNAs。中文檢索詞包括：結(jié)核、結(jié)核病、肺結(jié)核、微小RNA。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)研究類(lèi)型為病例對(duì)照研究；(2)研究對(duì)象為人類(lèi)；(3)樣本來(lái)源為外周血；(4)研究對(duì)象來(lái)源于臨床確診的活動(dòng)性結(jié)核病患者和排除活動(dòng)性結(jié)核病的對(duì)照組；(5)文獻(xiàn)明確闡明是研究循環(huán)miRNA與活動(dòng)性結(jié)核病診斷的關(guān)系，并能完整提取四格表數(shù)據(jù)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)非中、英文文獻(xiàn)；(2)重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn)；(3)研究對(duì)象為細(xì)胞系、動(dòng)物；(4)樣本來(lái)源為組織或其他體液的miRNA；(5)綜述、病例報(bào)告、會(huì)議記錄、畢業(yè)論文；(6)無(wú)法獲取全文,缺乏原始數(shù)據(jù)或其他關(guān)鍵信息。

1.2資料提取、文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)與偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià) 由2名研究者獨(dú)立進(jìn)行文獻(xiàn)檢索并根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，再仔細(xì)閱讀全文，對(duì)入選的文獻(xiàn)提取以下相關(guān)資料：第一作者、發(fā)表年限、國(guó)家、年齡、樣本量、樣本來(lái)源、miRNA、結(jié)核病類(lèi)型、對(duì)照人群、檢測(cè)方法、四格表數(shù)據(jù)、敏感性、特異性、ROC曲線下面積。根據(jù)QUADAS-2標(biāo)準(zhǔn)對(duì)納入的文獻(xiàn)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。在文獻(xiàn)篩選、數(shù)據(jù)提取及質(zhì)量評(píng)價(jià)過(guò)程中，如遇分歧與第三位研究者協(xié)商解決[4]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用Revman 5.3對(duì)文獻(xiàn)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，利用Stata 15.0對(duì)所獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行meta分析和異質(zhì)性分析。納入研究通過(guò)Q檢驗(yàn)判斷是否存在異質(zhì)性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為0.05，同時(shí)結(jié)合I2定量判斷異質(zhì)性的大小。若P>0.05或I2≤50%，說(shuō)明納入研究間異質(zhì)性較小，可以采用固定效應(yīng)模型；若P≤0.05或I2>50%，說(shuō)明納入研究間異質(zhì)性較顯著，則運(yùn)用隨機(jī)效應(yīng)模型,并分析異質(zhì)性來(lái)源。通過(guò)Spearman相關(guān)系數(shù)確定納入研究之間是否存在閾值效應(yīng)。Spearman相關(guān)分析顯示P>0.05，說(shuō)明不存在閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性。通過(guò)meta回歸分析、亞組分析和敏感性分析探索與閾值效應(yīng)無(wú)關(guān)的異質(zhì)性來(lái)源。計(jì)算納入文獻(xiàn)的合并敏感性(Sen)、特異性(Spe)、陽(yáng)性似然比(PLR)、陰性似然比(NLR)以及診斷比值比(DOR)等指標(biāo)，并繪制SROC曲線，計(jì)算曲線下面積(AUC)，AUC越接近1，表示其準(zhǔn)確價(jià)值越高。所有合并結(jié)果都以合并值和95%CI表示。利用Stata 15.0軟件作Deeks漏斗圖評(píng)估是否存在發(fā)表偏倚。

2 結(jié)果

2.1文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果 初檢出相關(guān)文獻(xiàn)1 600篇，根據(jù)文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn)排除文獻(xiàn)1 579篇，最終納入21項(xiàng)研究[5-25]。文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2納入研究的基本特征及質(zhì)量評(píng)價(jià) 共納入2 373例研究對(duì)象，其中病例1 142例，對(duì)照1 231例。納入研究的基本特征見(jiàn)表1。利用QUADAS-2所作出的文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)圖2。

表1 納入研究的基本特征

續(xù)表

2.3meta分析結(jié)果

2.3.1循環(huán)miRNA診斷活動(dòng)性結(jié)核病的準(zhǔn)確性 Spearman相關(guān)系數(shù)計(jì)算結(jié)果顯示r=0.48、P=0.23，提示納入文獻(xiàn)不存在閾值效應(yīng)。異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)研究間異質(zhì)性較大，采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行meta分析。結(jié)果顯示：合并敏感性為0.85(95%CI：0.78～0.89)，合并特異性為0.85(95%CI：0.81～0.88)，PLR為5.49(95%CI：4.21～7.15)，NLR為0.18(95%CI：0.13～0.26)，DOR為30.06(95%CI：16.88～53.52)，SROC曲線AUC為0.91(95%CI：0.88～0.93)。見(jiàn)圖3。

2.3.2meta回歸分析與亞組分析 利用meta回歸分析和亞組分析探索非閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性來(lái)源。通過(guò)單變量meta回歸分析，納入文獻(xiàn)的異質(zhì)性可能來(lái)源于研究國(guó)家、對(duì)照人群類(lèi)型、樣本量大小，見(jiàn)圖4。按對(duì)照人群類(lèi)型、病例組樣本量大小、年齡階段及miRNA類(lèi)型進(jìn)行亞組分析，分析結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，以非單一健康人作為對(duì)照人群的研究DOR顯著升高，敏感性輕度升高，說(shuō)明以非單一健康人作為對(duì)照組時(shí)能更好保證診斷準(zhǔn)確性。相較于成人，兒童miRNA對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病診斷價(jià)值更高。與其他miRNA相比，miR-29和miR-155作為診斷標(biāo)志物的研究較多，且miR-155的診斷價(jià)值較miR-29更大。亞組分析結(jié)果證實(shí)對(duì)照人群類(lèi)型、病例數(shù)的大小、人群年齡階段是引起異質(zhì)性的重要原因。

表2 亞組分析

2.3.3敏感性分析 由于僅有2篇[5，12]文獻(xiàn)出自中國(guó)以外的國(guó)家，無(wú)法計(jì)算合并靈敏度、特異度等指標(biāo)，所以通過(guò)敏感性分析進(jìn)一步追溯異質(zhì)性來(lái)源。此外，如二元箱線圖(圖5)所示，即4篇[12，16-17，23]文獻(xiàn)的5組研究數(shù)據(jù)未定位于箱線圖中，提示該4篇文獻(xiàn)可能是異質(zhì)性來(lái)源。逐一剔除單個(gè)研究后，對(duì)其余研究重新進(jìn)行meta分析，匯總結(jié)果見(jiàn)表3。分別剔除上述文獻(xiàn)后，合并的診斷比值比、靈敏度與特異度未見(jiàn)明顯變化，說(shuō)明meta分析結(jié)果較穩(wěn)定。

表3 敏感性分析

2.3.4發(fā)表偏倚分析 使用Stata 15.0制作Deeks漏斗圖，結(jié)果顯示t=-1.61，P>|t|=0.118，提示不存在發(fā)表偏倚。見(jiàn)圖6。

3 討論

miRNA主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因，與mRNA結(jié)合從而阻斷蛋白質(zhì)編碼基因表達(dá)，在基因表達(dá)、細(xì)胞發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生等多種生命過(guò)程中發(fā)揮重要作用。miRNA不僅廣泛存在于人體組織和細(xì)胞中，通過(guò)與Argonaute蛋白結(jié)合而避免被RNA酶降解，也穩(wěn)定地表達(dá)于血漿、血清和其他體液中，這種穩(wěn)定性使miRNA可能成為疾病診斷的生物標(biāo)志物[26]。目前miRNA在各種惡性腫瘤、膿毒血癥、結(jié)核病的早期診斷價(jià)值已備受關(guān)注[27-31]。Fu等[32]在肺結(jié)核患者血清中檢測(cè)1 223種miRNA，與健康人群相比，發(fā)現(xiàn)92個(gè)miRNA被調(diào)節(jié)，其中59個(gè)上調(diào)，33個(gè)下調(diào)。經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外已有不少研究探索循環(huán)miRNA對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病的診斷價(jià)值，但多為小樣本病例-對(duì)照研究，缺乏系統(tǒng)而定量的分析。

本文系統(tǒng)地回顧近年來(lái)miRNA用于活動(dòng)性結(jié)核病的臨床研究，并采用meta分析方法，克服單個(gè)研究樣本量小等不足，客觀地評(píng)估循環(huán)miRNA對(duì)診斷活動(dòng)性結(jié)核的價(jià)值。本研究結(jié)果顯示,循環(huán)miRNA診斷活動(dòng)性結(jié)核病的Sen、Spe、DOR、AUC分別為85%、85%、30.06、0.91，具有較高診斷價(jià)值，加之其檢測(cè)相對(duì)無(wú)創(chuàng)，可作為一種協(xié)同診斷方法。目前臨床常用皮膚結(jié)核菌素試驗(yàn)(tuberculin skin test，TST)和γ-干擾素釋放試驗(yàn)(interferon-gamma release assay，IGRAs)作為結(jié)核感染的輔助診斷試驗(yàn)，但有研究報(bào)道兩者對(duì)成人活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷效能均較低而不足為臨床診斷提供強(qiáng)有力的證據(jù)[33]。而本研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)miRNA的PLR和NLR分別為5.49和0.18，提示陽(yáng)性結(jié)果及陰性結(jié)果均有較高準(zhǔn)確性。

本研究通過(guò)meta回歸分析和亞組分析，提示對(duì)照人群類(lèi)型、病例組樣本量大小、年齡階段是導(dǎo)致異質(zhì)性的主要原因。亞組分析得出兒童循環(huán)miRNA對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病的診斷效能優(yōu)于成人，這可能與兒童免疫狀態(tài)與成人存在較大差異所致。在所有研究的miRNA中，miR-29和miR-155單獨(dú)診斷活動(dòng)性結(jié)核病時(shí)有較高敏感性及特異性，miR-155診斷活動(dòng)性結(jié)核病的DOR和AUC分別為26.88和0.90，其診斷效能高于miR-29。由于納入文獻(xiàn)不足，本研究尚未對(duì)結(jié)核分枝桿菌肺內(nèi)或肺外感染、涂片陰性或陽(yáng)性的病例作進(jìn)一步分析。但Pan等[11]發(fā)現(xiàn)結(jié)核性腦膜炎患兒循環(huán)miR-29a較健康兒童明顯升高，與柴璐璐[34]研究結(jié)果相似。李佩明[35]研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)miR-19a-3p可能成為脊柱結(jié)核早期診斷標(biāo)記物之一，其可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子的表達(dá)參與脊柱結(jié)核的病理過(guò)程。3篇文獻(xiàn)[14，23，25]報(bào)道了miRNA的表達(dá)在涂片陰性與陽(yáng)性活動(dòng)性結(jié)核病患者之間的差別，均提示涂片陽(yáng)性的患者循環(huán)miRNA較對(duì)照組差異更大，可能有更高診斷效能。

本研究的局限性：(1)病例組并未全部獲得病原學(xué)證據(jù)；(2)納入文獻(xiàn)僅有英語(yǔ)、漢語(yǔ)，可能存在語(yǔ)言偏倚；(3)納入研究大多數(shù)為中國(guó)地區(qū)，代表性不高，因此該結(jié)果外推到其他地區(qū)人群時(shí)要謹(jǐn)慎。

綜上所述，本研究證明循環(huán)miRNA可作為活動(dòng)性結(jié)核病的潛在診斷標(biāo)志物，但受納入文獻(xiàn)質(zhì)量和數(shù)量等限制，尚需要進(jìn)一步大規(guī)模高質(zhì)量研究予以驗(yàn)證，以促進(jìn)未來(lái)應(yīng)用于臨床診斷。