陸正 劉建剛

(1南通大學(xué)附屬海安醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 海安 226600；2蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科)

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)是一種高級(jí)別膠質(zhì)瘤，是人類最致命的癌癥之一〔1,2〕。盡管手術(shù)、放療和化療等多種治療手段得到了長(zhǎng)足發(fā)展，GBM患者的預(yù)后仍然很差，5年生存率不足5%〔3,4〕。GBM的發(fā)生和進(jìn)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多種分子和表觀遺傳學(xué)的變化〔5〕。因此，尋找與GBM發(fā)生發(fā)展相關(guān)的新的生物標(biāo)志物將對(duì)了解GBM的疾病進(jìn)程及評(píng)價(jià)疾病預(yù)后有很大幫助。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類內(nèi)源性RNA，不同于線性RNA，它的結(jié)構(gòu)為一個(gè)共價(jià)閉合的連續(xù)環(huán)，而且往往比線性mRNA更加穩(wěn)定〔6,7〕，以各種各樣的方式對(duì)基因表達(dá)起著調(diào)控作用。研究表明，circRNA在多種腫瘤中異常表達(dá)，可作參與各種腫瘤生物學(xué)進(jìn)程〔8～10〕。

到目前為止，在GBM中有關(guān)circRNA的研究仍然很少。本研究使用circRNA高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一些在GBM中異常表達(dá)的circRNAs，同時(shí)選取表達(dá)差異最大的circRNA-hsa_circ_0074027進(jìn)行研究，將其命名為circPITX1，并在GBM中驗(yàn)證其表達(dá)、探尋其生物學(xué)功能及臨床意義。

1 材料和方法

1.1患者和組織樣本 GBM組織及相應(yīng)正常腦組織(NBTs)共42對(duì)取自于南通大學(xué)附屬海安醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)的患者。本研究經(jīng)醫(yī)院研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且患者均簽署知情同意書，標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)。

1.2circRNA測(cè)序 用TRIzol試劑(Invitrogen,USA)提取3對(duì)GBM組織和相應(yīng)正常腦組織的總RNA。用RNase R試劑(Epicentre Technologies,USA)消化RNA，去除線性RNA，豐富circRNA。在Illumina HeSeq 2000平臺(tái)(Illumina，USA)上進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果用Cluster3.0軟件(University of Tokyo,Human Genome Center)進(jìn)行分析。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人GBM細(xì)胞系U251、U87、A172、LN229及正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞系NHA均來(lái)自美國(guó)ATCC公司。細(xì)胞均在DMEM培養(yǎng)基(Gibco，USA)中培養(yǎng)，輔以10%胎牛血清(Gibco)。所有細(xì)胞系在37℃，含5% CO2的濕潤(rùn)環(huán)境中培養(yǎng)。采用Lipofectamine 3000試劑(Invitrogen)將circPITX1 siRNA轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)251和LN229細(xì)胞；circPITX1 siRNA的靶序列為GCGUGCUAAGCACCUGGCGCA。

1.4RNA提取和qRT-PCR 用Trizol試劑(invitrogen)從GBM組織及細(xì)胞株中提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，日本)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix(Takara)，并在Roche LightCycler 480實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Apple BioSosies)上進(jìn)行。用2-ΔΔCt法計(jì)算circPITX1相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參。引物序列如下：circPITX1-正義鏈:5'-CCATAGTCCGAGCGTGCTAA-3',circPITX1-反義鏈:5'-G-TCTGTCTTAAAGCGACAGCG-3'；GAPDH正義鏈:5'-TATGATGATATCAAGAGGGTAAGT-3',GAPDH反義鏈:5'-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3'。

1.5細(xì)胞增殖及遷移能力測(cè)定 使用特異性siRNA在GBM細(xì)胞中沉默circPITX1(circPITX1 siRNA組)，未沉默circPITX1為NC組，進(jìn)行體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。在U251和LN229細(xì)胞中轉(zhuǎn)染circPITX1 siRNA測(cè)定細(xì)胞的增殖及遷移能力。用CCK-8試劑盒(beyotime，中國(guó))測(cè)定細(xì)胞增殖活性。將U251和LN229細(xì)胞接種于96孔板中，密度為2×103/孔。在不同時(shí)間點(diǎn)，在每孔中分別加入100 μl無(wú)血清培養(yǎng)基和10 μl CCK-8溶液。然后將培養(yǎng)板在37℃下孵育1 h。在分光光度計(jì)上測(cè)量450 nm處的吸光度。細(xì)胞遷移能力采用劃痕實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估。細(xì)胞在6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)至90%融合，用無(wú)菌的10 μl微量移液管尖端輕輕地劃傷附著的細(xì)胞，在單層細(xì)胞中形成一個(gè)劃痕(時(shí)間0 h)。隨后，用無(wú)血清培養(yǎng)基孵育細(xì)胞24 h，用顯微鏡拍攝細(xì)胞遷移情況。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析運(yùn)用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)或單因素方差分析比較組間差異；生存分析采用Kaplan-Meier法統(tǒng)計(jì)，單因素及多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。

2 結(jié) 果

2.1GBM組織中circRNA表達(dá)譜分析 9個(gè)circRNA表達(dá)明顯上調(diào)，8個(gè)circRNA表達(dá)明顯下調(diào)(差異倍數(shù)>2,P<0.05,圖1)。其中hsa_circ_0074027即circPITX1表達(dá)明顯上調(diào)，且差異倍數(shù)最大(差異倍數(shù)=8.34,圖1)。

2.2circPITX1在GBM組織和細(xì)胞系中高表達(dá) GBM組織中circPITX1的表達(dá)量(2.608±1.207)明顯高于正常腦組織NBTs(1.279±0.704,P<0.05)。U251、U87、A172、LN229細(xì)胞系及NHA細(xì)胞系中circPITX1的表達(dá)分別為(2.593±0.065)、(1.790±0.111)、(2.377±0.070)、(2.793±0.169)、(0.997±0.085)。GBM細(xì)胞系中circPITX1的表達(dá)同樣上調(diào)(P<0.05)。證實(shí)circPITX1在GBM組織和細(xì)胞系中高表達(dá)。

2.3circPITX1水平與GBM患者臨床病理因素的相關(guān)性 根據(jù)用circPITX1相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)將42例GBM患者分為circPITX1高表達(dá)組(n=21)和circPITX1低表達(dá)組(n=21)，通過(guò)與患者臨床病理因素進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，circPITX1的表達(dá)與腫瘤直徑和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表1。表明circPITX1的表達(dá)量能夠提示GBM的進(jìn)展情況。

圖1 GBM組織中circRNA表達(dá)譜

表1 circPITX1表達(dá)與GBM患者臨床病理因素關(guān)系(n)

臨床因素ncircPITX1高表達(dá)組circPITX1低表達(dá)組P值性別 男 女25171291380.753年齡 ≤60歲 >60歲30121471650.494腫瘤直徑 ≤5 cm >5 cm18245161380.013術(shù)前KPS(分) ≤70 >7016264171290.121IDH1突變 是5230.634 否371918腫瘤家族史 是8350.432 否341816遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 是171430.001 否25718

KPS：卡氏評(píng)分

2.4circPITX1水平與GBM患者預(yù)后的關(guān)系 如圖2所示， Kaplan-Meier生存分析結(jié)果表明，circPITX1高表達(dá)組GBM患者的總體生存時(shí)間明顯低于circPITX1低表達(dá)組(P<0.05)。因此， circPITX1的表達(dá)可作為預(yù)測(cè)GBM患者預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。

圖2 circPITX1高表達(dá)組與低表達(dá)組GBM 患者的總體生存情況對(duì)比

2.5circPITX1水平是影響GBM患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素 如表2所示，COX單因素分析表明術(shù)前KPS、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和circPITX1水平是影響GBM患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。而COX多因素分析表明，術(shù)前KPS和circPITX1是影響GBM患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。此結(jié)果表明circPITX1水平是影響GBM患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

2.6circPITX1促進(jìn)GBM細(xì)胞增殖和遷移 circPITX1促進(jìn)GBM細(xì)胞增殖和遷移(P<0.05)，見(jiàn)表3、4，圖3。

表2 影響GBM患者總體生存的單因素及多因素分析

表3 兩組circPITX1表達(dá)及遷移活性比較

與NC組比較：1)P<0.05;下表同

表4 兩組培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞增殖情況比較

圖3 circPITX1 siRNA對(duì)U251和LN229細(xì)胞遷移的影響

3 討 論

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)在腫瘤中異常表達(dá)。而circRNA作為新興分子，在近年來(lái)越來(lái)越受到關(guān)注。而且，研究辨明circRNA的異常表達(dá)在多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。Cheng等〔11〕通過(guò)檢測(cè)肺鱗狀細(xì)胞癌中circRNA的表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)circTP63表達(dá)上調(diào)，其上調(diào)與肺鱗狀細(xì)胞癌患者腫瘤大小和TNM分期有關(guān)，且circTP63在體內(nèi)外都能促進(jìn)細(xì)胞增殖；Jiao等〔12〕通過(guò)微陣列芯片發(fā)現(xiàn)hsa-circ-0000745在宮頸癌中高表達(dá)，并通過(guò)減少E-cadherin的表達(dá)，增強(qiáng)了細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

在GBM中，也有有關(guān)circRNA的相關(guān)研究，但很少。Xia等〔13〕的研究表明circ-AKT3在GBM組織中的表達(dá)降低，其編碼一種174個(gè)氨基酸，能夠降低GBM細(xì)胞的增殖能力、抗輻射能力和體內(nèi)致瘤性;Lu等〔14〕報(bào)道circ_0001730通過(guò)mir-326/WNT7b軸激活wnt/β-catenin通路促進(jìn)GBM細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲;Li等〔15〕通過(guò)檢測(cè)circRNA表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)circ_0001946 在GBM細(xì)胞中表達(dá)降低，且證實(shí)circ_0001946 /miR-671-5p/CDR1通路對(duì)GBM的發(fā)生發(fā)展具有調(diào)節(jié)作用。因此，circRNAs可能通過(guò)多種方式參與了GBM的生物學(xué)進(jìn)程，并在這些過(guò)程中可以作為生物學(xué)標(biāo)志物提示GBM的疾病進(jìn)程。

本研究結(jié)果表明，circPITX1在GBM組織和細(xì)胞中高表達(dá)并可促進(jìn)GBM細(xì)胞增殖和遷移，其表達(dá)量可作為提示GBM的進(jìn)展情況及預(yù)測(cè)GBM患者預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物，而具體的機(jī)制仍有待探究。