翟麗麗 張冰 徐丹丹 郭家鼎 陳文靜

(1齊齊哈爾市第一醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000；2齊齊哈爾市中醫(yī)院)

肺癌是一種惡性度極高的疾病，發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤首位。我國每年的肺癌新增病例約為65萬，占全球新發(fā)病例總數(shù)的三分之一〔1〕。肺癌又稱“老年癌”，即老年人罹患肺癌概率更大。非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌的一種病理分型，其中50%左右的NSCLC患者屬于肺腺癌亞型〔2〕。以前對于肺腺癌的治療一般是根據(jù)指南選擇合適的藥物進行化療。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，精準醫(yī)療的概念逐漸形成，治療進入到個體化分子靶向階段。部分肺腺癌中存在間變性淋巴瘤激酶 (ALK)基因變異現(xiàn)象，主要是由于ALK基因發(fā)生重排或與其他基因融合〔3〕。而生存素(Survivin)是近年來發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(IAPs)家族中的一員，具有抑制腫瘤細胞凋亡，同時促進其有絲分裂的作用，在腫瘤細胞中存在過度表達的現(xiàn)象〔4〕。本研究通過免疫組化(SP)法檢測Survivin和ALK在老年肺腺癌患者胸腔積液中的表達水平，分析兩者與臨床病理特征的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1研究對象 將2017年2月至2019年2月于齊齊哈爾市第一醫(yī)院呼吸科確診的老年胸腺癌伴隨胸腔積液患者52例納入觀察組，納入標準：①經(jīng)病理學/細胞學證實為原發(fā)性肺腺癌患者；②經(jīng)影像學檢查存在胸腔積液患者；③年齡≥60歲；④未經(jīng)胸膜腔內(nèi)化療、局部放療及免疫治療的患者；⑤預計生存期≥2 個月；⑥未合并嚴重心腦血管疾病、肝腎功能障礙者。排除標準：①不符合上述標準者；②存在胸部積液引流的絕對禁忌證；③依從性差或拒不配合檢查者。年齡60～80歲，中位年齡72歲。根據(jù)國際肺癌研究協(xié)會(IASLC)2009年第7版分期標準分為〔5〕：Ⅰ期中Ⅰa 5例，Ⅰb 7例，Ⅱ期中Ⅱa 14例，Ⅱb 13例、Ⅲ 期中Ⅲa 10例，Ⅲb3例。所有病例未見遠端轉(zhuǎn)移。

另擇同期確診為良性疾病伴隨胸腔積液患者48例納入對照組，男25例，女23例，年齡60～78歲，中位年齡70歲。其中<70歲20例，≥70歲28例。其中30例為肺結(jié)核所致胸腔積水，18例為肺炎所致胸腔積水。有吸煙史患者20例，無吸煙史患者28例?；颊呔哂型暾呐R床病理資料并完成所有的術(shù)后隨訪，兩組一般資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2試劑與儀器 兔抗人Survivin多克隆抗體(Abcam公司，英國)，兔抗人ALK(D5F3)單克隆抗體(CST公司，美國)，SP二抗檢測試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑(均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國)，磷酸鹽緩沖液(PBS)、枸櫞酸緩沖液(均為實驗室自制)。低溫高速離心機(Eppendorf，USA)、輪轉(zhuǎn)切片機(LEICA，Germany)、恒溫箱(上海躍進醫(yī)療器械廠，中國)、移液槍(Eppendorf，USA)、Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)(北京麥克奧迪圖像技術(shù)有限公司，中國)。

1.3樣本制備 經(jīng)胸腔閉式引流術(shù)或術(shù)中直接提取獲得胸腔積液，每例200 ml。將得到的胸腔積液于30 min內(nèi)分裝至50 ml離心管，配平后置于低溫離心機內(nèi)離心。設(shè)定條件：溫度為4℃，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，離心半徑14 cm，離心時間10 min。完畢后小心棄去上清液，得到胸腔積液沉渣。加入濃度為10%的中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切成厚度為4 μm的連續(xù)切片備用。

1.4SP法 取制備好的切片，放置已預熱至60℃的恒溫箱中，加熱20 min，使切片緊密黏附。經(jīng)二甲苯常規(guī)脫蠟、梯度酒精脫水后，將切片轉(zhuǎn)移至蒸餾水中浸泡待用。棄去蒸餾水，于37℃下用濃度3%的H2O2溶液孵育切片10 min，以滅活內(nèi)源性的過氧化物酶。PBS沖洗3次，轉(zhuǎn)移至放有0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH6.0)的燒杯中煮沸15～20 min，室溫下冷卻20 min，而后采用冷毛巾法加快冷卻至室溫，以修復抗原。PBS沖洗3次，于37℃下用工作液封閉血清10 min，滴加一抗(兔抗人Survivin多克隆抗體或兔抗人ALK單克隆抗體)，4℃冰箱孵育過夜。PBS沖洗三次，滴加二抗，室溫下孵育30 min。PBS沖洗三次，用新鮮配置的DAB溶液顯色，用蒸餾水沖洗，用蘇木素復染30 s，反藍，用蒸餾水沖洗后，常規(guī)脫水、透明、干燥后封片。用自制的PBS替代一抗作為陰性對照，全過程由同一高年資的醫(yī)生完成，將人為誤差降到最小。

1.5結(jié)果判定 Survivin陽性細胞定義〔6〕：細胞質(zhì)和(或)細胞核出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒。每個組織切片先于100倍物鏡下隨機選擇5個表達最密區(qū)，后于400倍物鏡下計算陽性細胞數(shù)百分比，對陽性細胞比例和染色強度進行評價。染色強度定義：無明顯著色計0分，表示陰性；淡黃色顆粒計1分，表示弱陽性；黃色顆粒計2分，表示中陽性；棕黃色顆粒記為3分，表示強陽性。對視野中的陽性細胞和全部細胞分別計數(shù)，計算陽性細胞比例。以染色強度與陽性細胞比例的乘積作為最終評分，積分≥1者認為表達陽性，<1者認為表達陰性。

ALK陽性細胞定義〔7〕：細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒。采用二分類計分法，細胞質(zhì)內(nèi)存在棕褐色顆粒即為陽性，否則即為陰性。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0軟件進行t檢驗，χ2檢驗或校正χ2檢驗，秩和檢驗，Spearman 相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1Survivin蛋白和ALK蛋白在胸腔積液中的表達 染料可選擇性的將Survivin和ALK染成棕黃色顆粒或棕褐色顆粒，從而定位該蛋白。結(jié)果可見，Survivin蛋白在觀察組和對照組胸腔積液細胞中部分表達，且呈無規(guī)律分布，主要分布于細胞質(zhì)中，少數(shù)分布于細胞核內(nèi)；ALK蛋白只在觀察組胸腔積液細胞中表達，且只分布于細胞質(zhì)中，細胞核內(nèi)未見染色，見圖1和圖2。Survivin蛋白在觀察組中的陽性表達率(73.08%)明顯高于對照組(26.92%，χ2=43.359，P=0.000)；ALK蛋白在觀察組中的陽性表達率為7.69%，在對照組的陽性表達率0.00%，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2.104，P=0.147)。

圖1 兩組Survivin蛋白(SP法，×100)

2.2Survivin、ALK蛋白表達與臨床病理特征關(guān)系 Survivin蛋白表達與臨床分期、腫瘤直徑、淋巴轉(zhuǎn)移情況、生存狀態(tài)有關(guān)(P<0.05)；與性別、年齡、分化程度、吸煙史無關(guān)(P>0.05)。ALK蛋白表達與臨床分期和生存狀態(tài)有關(guān)(P<0.05)；與性別、年齡、分化程度、腫瘤最大直徑、淋巴轉(zhuǎn)移情況、吸煙史無關(guān)(P>0.05)，見表1。

圖2 兩組ALK蛋白表達(SP法，×100)

表1 Survivin、ALK蛋白在不同臨床病理特征中的表達〔n(%)〕

2.3相關(guān)性分析 Survivin蛋白與ALK蛋白表達不相關(guān)(P>0.05)，見表2。

表2 Survivin蛋白與ALK蛋白表達的相關(guān)性

3 討 論

肺癌診斷的金標準是病理檢查，通過穿刺活檢或直接術(shù)中獲得病理組織或細胞樣本是診斷的關(guān)鍵。然而老年肺腺癌患者生理功能減退，免疫力低下，且容易合并多種慢性病，多數(shù)患者在初次就診時肺功能已低于正常水平，無法進行手術(shù)治療。穿刺活檢是一種創(chuàng)傷取樣的手段，容易造成氣胸、血胸、胸膜反應、壓縮性肺不張等不良反應，因此以最小的傷害獲取可信度最高的病理樣本是肺腫瘤診斷中的重要環(huán)節(jié)〔8〕。胸腔積液是肺腺癌患者常見并發(fā)癥，且隨著病情進展逐漸加重。惡性胸腔積液中的腫瘤細胞在癌細胞浸潤、轉(zhuǎn)移等過程中起著重要作用，同時也是病理診斷中的重要依據(jù)〔9〕。對于無法進行手術(shù)或不宜穿刺活檢的患者，獲取胸腔積液的操作簡單，同時也是緩解其臨床癥狀一種手段，具有良好的可行性。

Survivin蛋白在正常的終末分化組織中幾乎不表達，生理狀態(tài)下僅表達于成人分泌期子宮內(nèi)膜、胎盤、睪丸、胸腺及胚胎中，病理狀態(tài)下廣泛分布于人類各種惡性腫瘤組織中〔10〕。自1997年發(fā)現(xiàn)至今，Survivin蛋白一直是腫瘤治療的作用靶點。本研究結(jié)果表明Survivin蛋白在老年肺腺癌胸腔積液中是異常表達的。免疫組化結(jié)果顯示，Survivin蛋白在細胞核和細胞質(zhì)中均有分布，這可能與其抑制腫瘤細胞凋亡，同時促進其有絲分裂的功能有關(guān)。當其位于細胞核線粒體中時，可以抑制細胞色素C通路，保護細胞免于凋亡；當其位于胞質(zhì)內(nèi)時，直接作用于終末效應器半胱天冬氨酸酶(caspase)-3、caspase-7等，抑制細胞凋亡；因Survivin的表達具有細胞周期性，只在細胞周期G2/M期特異性表達，因此可以促進腫瘤細胞的有絲分裂。Wu等〔11〕研究表明Survivin陰性表達的NSCLC患者其中位生存期要明顯高于陽性表達著，Survivin表達情況是NSCLC預后評估的獨立影響因子。馬建梅等〔12〕研究認為Survivin蛋白是病情進展及臨床分期的評估指標之一。而腫瘤的最大直徑、淋巴轉(zhuǎn)移情況均與臨床分期密切相關(guān)，因此本研究結(jié)論與前人研究〔11,12〕相符。

ALK融合基因是在肺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的重要危險因素。最新指南中明確建議進展期NSCLC患者盡可能地確定臨床亞型，均應進行內(nèi)皮生長因子EGFR及ALK融合基因篩查，可以更好地開展治療。ALK融合基因陽性表達是肺腺癌的一個獨立分子類型，具有較為獨特的臨床病理特征。國外研究〔13〕報道，ALK融合基因在NSCLC中的陽性率為4.9%。ALK融合基因的危險因素包括：不吸煙、年輕、男性、腺癌。國內(nèi)研究〔14〕顯示，ALK融合基因在NSCLC中的陽性率為4.2%；在腺癌中的融合率升至10%。本研究與上述研究結(jié)果一致。本研究中研究對象為老年肺腺癌患者，對于年齡已做了設(shè)定，所以未顯示出ALK表達與年齡的相關(guān)性。再者因為陽性樣本量過小，只有4例，所以在性別、分化程度、腫瘤最大直徑、淋巴轉(zhuǎn)移情況、吸煙史等方面的差異性未曾顯現(xiàn)。應擴大樣本進一步研究。Survivin蛋白是通過抑制效應性蛋白酶實現(xiàn)抗凋亡作用的，其合成還具有細胞周期性，從而實現(xiàn)促增殖的作用；而ALK蛋白是一種絡氨酸酶，兩者并不存在通路上下游的關(guān)系，而是從兩個不同的機制促進肺腺癌細胞的異常增殖、分化過程，因此不存在表達相關(guān)性〔15〕。