李天梁 徐亮 李蜀華 冷尉

(1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，四川 瀘州 646000；2自貢市第一人民醫(yī)院普外科)

直腸癌是一種臨床較為常見的消化道惡性腫瘤，主要發(fā)生于齒狀線和直腸乙狀結(jié)腸交界處。直腸癌具有轉(zhuǎn)移性及高復(fù)發(fā)性的特點，因此晚期直腸癌患者的預(yù)后未得到明顯改善。

直腸癌的發(fā)生發(fā)展與諸多因子、信號通路密切相關(guān)，目前臨床醫(yī)學(xué)尚未將直腸癌的發(fā)病機(jī)制研究透徹，對直腸癌的分子發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究，對改善直腸癌患者療效和預(yù)后具有重要意義。CXCR4與某些特定的miRNAs具有調(diào)控關(guān)系，從而對腫瘤轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。本研究擬分析微小RNA(miR)-126的表達(dá)水平與CXCR4及直腸癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1研究對象 選取2010年1月至2016年3月92例西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院直腸癌手術(shù)病人切除標(biāo)本及距切緣遠(yuǎn)端5 cm以外正常組織標(biāo)本，均手術(shù)分離并在術(shù)后立即置于液氮中保存。

納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者臨床病歷資料齊全，術(shù)前未接受過放療、化療等相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：病歷資料不全患者；并發(fā)其他惡性腫瘤患者；腎、肺等器官衰竭或功能不全患者。本研究所有患者及家屬知情，簽署知情同意書，并獲得該院倫理委員會批準(zhǔn)。直腸癌患者平均年齡(61.4±12.4)歲；分化程度：高分化19例(20.65%)，中分化56例(62.22%)，低分化17例(18.48%)。

主要試劑：兔抗大鼠miR-126抗體(Invitrogen公司)；兔抗小鼠CXCR4抗體(Hyclone公司)；PCR緩沖液(Selleck公司)；MgCl2溶液(Sigma公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，Dako公司)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白緩沖液(Gibco 公司)；TBST液(Amresco公司)；枸櫞酸緩沖液(天根生化科技有限公司)；山羊血清(BD公司)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本制作 取收集的直腸癌組織及癌旁正常組織，使用4%中性甲醛固定，并進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，厚度為3 μm，連續(xù)切片作免疫組化標(biāo)記。

1.2.2應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測CXCR4 mRNA的表達(dá)水平 依次加入2.5 μl的稀釋10倍的PCR，1.5 μl MgCl2溶液，0.5 μl上游引物和下游引物，最后加水配成總體積為25 μl的反應(yīng)體系。在94℃環(huán)境中1 min；55℃環(huán)境中反應(yīng)1 min；72℃環(huán)境中反應(yīng)1 min，進(jìn)行35個循環(huán)，72℃環(huán)境中反應(yīng)延長5 min，重復(fù)最少三次。采用2-△△Ct方法計算CXCR4 mRNA表達(dá)水平。

1.2.3Western印跡法檢測miR-126、CXCR4蛋白表達(dá) 使用PBS液清洗標(biāo)本三次，分離緩沖液之后裂解0.5 h，測定蛋白濃度。取20 μg/孔蛋白質(zhì)，加入適量SDS-PAGE蛋白緩沖液后電泳10 min，在10%的牛奶中浸泡電轉(zhuǎn)膜，搖床上常溫封閉1.5 h；與一抗結(jié)合之后使用TBST進(jìn)行稀釋，并孵育、保存；次日使用TBST液進(jìn)行清洗，與二抗結(jié)合后常溫孵育1 h，再次清洗，加入顯影劑顯色，對miR-126、CXCR4相對表達(dá)量進(jìn)行檢測。

1.2.4免疫組化染色 對待測標(biāo)本進(jìn)行脫蠟、水化等處理之后，將其在0.01 mol/L、95℃的枸櫞酸緩沖液中浸泡，并進(jìn)行熱修復(fù)，并在3% H2O2的環(huán)境下進(jìn)行培育，10 min后滴入山羊血清進(jìn)行封閉，在25～27℃的環(huán)境下孵育0.5 h，之后將封閉液抽離，加入一抗，將其置于5℃的環(huán)境中過夜培養(yǎng)，次日加入二抗，并在恒溫箱中培養(yǎng)0.5 h(恒溫箱溫度37℃)，使用PBS沖洗后進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、脫水、封片處理，最后進(jìn)行鏡檢。由該院專業(yè)醫(yī)師進(jìn)行閱片。使用PBS替代一抗為陰性對照，陽性對照則使用陽性切片。按照標(biāo)本染色程度評分：強(qiáng)染色：3分；中染色：2分；弱染色：1分；無染色：0分。按照染色細(xì)胞比例評分：<5%：0分；≥5%且<25%：1分；≥25%且<50%：2分；≥50%且<75%：3分；≥75%：4分。計算兩項評分的總分，(-)：0分；(+)：1～2分；()：3～5分；()：6～7分。

1.3統(tǒng)計處理 采用SPSS21.0軟件，計量資料兩組間比較實施獨立樣本t檢驗。多因素回歸分析中，因變量為連續(xù)型變量時采用多重線性回歸模型，因變量為二分類變量時采用Logistic回歸模型。

2 結(jié) 果

2.1miR-126蛋白及CXCR4 mRNA在癌組織、癌旁組織中的表達(dá)對比 直腸癌組織中miR-126蛋白表達(dá)(0.15±0.03)明顯低于癌旁組織(0.35±0.07)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；直腸癌組織中CXCR4 mRNA表達(dá)(0.56±0.06)明顯高于癌旁組織(0.12±0.02)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2直腸組織中CXCR4蛋白的表達(dá) 直腸癌組織中CXCR4蛋白表達(dá)高于癌旁組織，見圖1。CXCR4在直腸癌組織細(xì)胞質(zhì)中大量表達(dá)，而在正常的直腸組織中呈不表達(dá)或弱陽性表達(dá)狀態(tài)，見圖2。

1：直腸癌組織；2：癌變組織圖1 CXCR4蛋白在直腸癌組織中的表達(dá)

2.3miR-126、CXCR4表達(dá)與直腸癌臨床參數(shù)的關(guān)系 miR-126、CXCR4表達(dá)與直腸癌患者性別、年齡無關(guān)，與直腸癌患者腫瘤體積、病理分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，腫瘤體積較大、Ⅲ+Ⅳ期、分化程度較低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者miR-126表達(dá)明顯降低，CXCR4表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.4直腸癌患者預(yù)后多因素Logistic回歸分析 腫瘤體積、miR-126表示、CXCR4表達(dá)、病理分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等為直腸癌患者預(yù)后的影響因素，其中miR-126、CXCR4表達(dá)為直腸癌患者預(yù)后的獨立預(yù)測因素。見表2。

表1 miR-126、CXCR4表達(dá)水平與直腸癌臨床參數(shù)的關(guān)系

表2 直腸癌患者預(yù)后多因素Logistic回歸分析

3 討 論

miR-126是miRNAs的重要組成部分，本研究表明，直腸癌細(xì)胞中miR-126能夠通過調(diào)控靶基因CXCR4，進(jìn)而起到抑制直腸癌細(xì)胞發(fā)展的作用。

臨床研究表明，miR-126在宮頸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中呈異常低表達(dá)〔1〕。本研究結(jié)果說明miR-126的表達(dá)可能與直腸癌的發(fā)生發(fā)展具有密切聯(lián)系，在直腸癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移過程中起到關(guān)鍵作用。但是，目前醫(yī)學(xué)界對miR-126表達(dá)與直腸癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性具有一定爭議，有學(xué)者研究顯示，miR-126的異常表達(dá)與直腸癌的發(fā)生發(fā)展并無必然聯(lián)系〔2〕。Santarelli等〔3〕發(fā)現(xiàn)，miR-126在惡性胸膜間皮瘤中呈現(xiàn)異常低表達(dá)，但是miR-126的表達(dá)變化與臨床病理分期無相關(guān)性。還有學(xué)者對結(jié)腸癌中miR-126表達(dá)進(jìn)行檢測，得出miR-126異常低表達(dá)與腫瘤分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無相關(guān)性的結(jié)論〔4〕。

miRNAs能夠?qū)盒阅[瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。miR-126能夠靶向調(diào)控VEGF、CXCR4、PIK3R2等靶基因，從而起到抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散的作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)在直腸癌細(xì)胞中miR-126通過調(diào)控IRS-1的表達(dá)對AKT和ERK1/2信號通路造成影響〔5〕。袁麗倩等〔6〕發(fā)現(xiàn)，CXCR4在大腸癌中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，其表達(dá)水平的變化對大腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力造成一定的影響，與腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等密切相關(guān)。CXCR4在直腸癌中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，且其表達(dá)的變化與惡性腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后具有一定相關(guān)性。葛新等〔7〕在研究中發(fā)現(xiàn)，SDF-1/CXCR4信號通路與惡性腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，CXCR4在直腸癌中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，因此推測CXCR4的表達(dá)變化可能與直腸癌的發(fā)生發(fā)展具有一定相關(guān)性，而且CXCR4表達(dá)與直腸癌病理特征具有一定相關(guān)性，與直腸癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。大量臨床研究表明，miRNAs的異常表達(dá)對乳腺癌、胃癌、直腸癌等惡性腫瘤的發(fā)展和預(yù)后具有一定的預(yù)測價值〔8～10〕。近年來，許多專家學(xué)者致力于miR-126與惡性腫瘤發(fā)展之間關(guān)系的研究，得出miR-126的異常表達(dá)與乳腺癌、惡性間皮瘤、肝細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌及成人T細(xì)胞白血病等惡性腫瘤患者的預(yù)后具有一定相關(guān)性的結(jié)論〔11～15〕。本研究也認(rèn)為miR-126、CXCR4表達(dá)為直腸癌患者預(yù)后的獨立預(yù)測因素。SDF-1/CXCR4信號通路對癌細(xì)胞的侵襲、遷移具有一定的調(diào)控作用，因此本研究推測miR-126表達(dá)與直腸癌患者預(yù)后的相關(guān)性可能是由于miR-126靶向調(diào)控CXCR4表達(dá)導(dǎo)致的。

綜上所述，miR-126在直腸癌中呈異常低表達(dá)、CXCR4蛋白在直腸癌中呈異常高表達(dá)，二者與直腸癌病理特征具有一定相關(guān)性，是直腸癌患者預(yù)后的獨立預(yù)測因素。