焦俊霞 葉曉霞

(馬鞍山市中心醫(yī)院病理科，安徽 馬鞍山 243000)

結(jié)直腸癌是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病率位居惡性腫瘤第4位，死亡率居第5位〔1〕。結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展與腸上皮細(xì)胞的凋亡、增殖速度密切相關(guān)，多種基因、信號蛋白參與了這個(gè)過程；其中，表皮生長因子受體(EGFR)、P53基因主要通過調(diào)控細(xì)胞周期，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化，對腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展起重要作用。Ki-67是與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核抗原，是評估人體各種組織、細(xì)胞增殖簡單可靠的指標(biāo)。EGFR、P53、Ki-67均參與了腫瘤細(xì)胞的增殖與分化。本研究采用免疫組化法檢測結(jié)直腸癌組織中EGFR、P53及Ki-67蛋白的表達(dá)，并進(jìn)一步分析其與臨床病理特征之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 收集2015年1月至2018年1月馬鞍山市中心醫(yī)院病理科存檔的87例結(jié)直腸癌手術(shù)標(biāo)本，所有病例手術(shù)前未行臨床治療(如放療、化療)。同時(shí)選取同病例癌旁正常腸黏膜87例作為對照。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合會(huì)(UICC/AJCC)第8版消化道腫瘤TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行臨床病理分期。

1.2試劑與方法 所送檢手術(shù)標(biāo)本常規(guī)采用4%甲醛溶液充分固定，石蠟包埋后4 μm厚連續(xù)切片，并進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色及免疫組化標(biāo)記。采用S-P免疫組化法，每例分別檢測EGFR (克隆號SP9)、P53(克隆號SP5)、Ki-67(克隆號MIB-1)蛋白的表達(dá)，并設(shè)立陰性對照。本研究所用抗體及免疫組織化學(xué)試劑盒均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.3結(jié)果判斷 EGFR陽性表達(dá)定位于細(xì)胞膜。其陽性程度判斷根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)比例分4級：無陽性細(xì)胞(-)，<25%(+)、25%～50%()，≥50%()，細(xì)胞的染色深淺不作為判斷陽性程度的指標(biāo)。P53和Ki-67陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核。P53陽性程度判讀根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)評分：1分為淡棕色，2分為棕黃色，3分為棕褐色; 陽性細(xì)胞數(shù)≤25%為1分，26%～50% 為2分，51%～74%為3分，≥75%為4分; 染色程度評分與陽性細(xì)胞數(shù)評分相加：0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中度陽性()，6～7分為強(qiáng)陽性()。Ki-67陽性細(xì)胞分3個(gè)等級：Ⅰ級為陽性細(xì)胞數(shù)<10%(-)，Ⅱ級為10%～50%(+)，Ⅲ級為>50%() 。評分過程由2名病理科醫(yī)生獨(dú)立完成。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)或Fisher的精確檢驗(yàn)法、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1EGFR、P53和Ki-67在結(jié)直腸癌和癌旁組織中的表達(dá) EGFR、P53蛋白在結(jié)直腸癌組織中陽性表達(dá)率分別為35.6%(31/87)、65.5%(57/87)，而癌旁正常腸黏膜組織幾乎不表達(dá)〔2.3%(2/87)、4.6%(4/87)〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=31.449、70.908，均P=0.000)。Ki-67蛋白在結(jié)直腸癌組織中陽性表達(dá)率為95.4%(83/87)，而癌旁正常腸黏膜組織內(nèi)Ki-67蛋白僅在腺體頸部有少量細(xì)胞核染色，陽性表達(dá)率為4.6%(4/87)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=158.703,P=0.000)。EGFR、P53和Ki-67蛋白在結(jié)直腸癌組織同時(shí)陽性表達(dá)26例(29.9%)。見圖1，圖2。

圖1 EGFR、Ki-67、P53在癌旁正常黏膜組織中的表達(dá)(免疫組化，×200)

圖2 EGFR、Ki-67、P53在結(jié)直腸癌中的表達(dá)(免疫組化，×400)

2.2EGFR、P53和Ki-67蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系 EGFR、 P53和Ki-67蛋白陽性表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性，即隨腫瘤進(jìn)展其陽性表達(dá)率增高(P<0.05)；與患者年齡、性別、大體類型無相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

2.3EGFR、P53和Ki-67表達(dá)的相關(guān)性 在結(jié)直腸癌組織中EGFR與P53蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，即隨腫瘤進(jìn)展其陽性表達(dá)率增高(r=0.287,P=0.007)；Ki-67與EGFR、P53表達(dá)無相關(guān)性(r=0.163、0.049，P=0.131、0.654)。

表1 EGFR、 P53 和 Ki-67 蛋白陽性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(n)

3 討 論

EGFR為酪氨酸蛋白激酶家族成員之一，屬于酪氨酸激酶Ⅰ型受體，當(dāng)其與配體結(jié)合后可活化下游RAS/RAF/MAPK和PI3K/AKT/mTOR通路從而啟動(dòng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、分化和侵襲〔2〕，其過度表達(dá)常提示腫瘤患者可能預(yù)后差、轉(zhuǎn)移早、生存期短〔3〕，可作為判斷結(jié)直腸癌進(jìn)展、預(yù)后和轉(zhuǎn)歸的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中EGFR表達(dá)水平與腫瘤的分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況顯著相關(guān)，與邵好青等〔4〕報(bào)道基本一致。近年來關(guān)于結(jié)直腸癌的治療，EGFR作為一個(gè)重要藥物靶點(diǎn)，有兩類EGFR拮抗劑獲準(zhǔn)應(yīng)用于臨床，分別為抗EGFR單克隆抗體(如西妥昔單抗、帕尼單抗)和小分子EGFR酪氨酸激酶抑制劑(如埃羅替尼和吉非替尼)。

P53基因是調(diào)控人體細(xì)胞增殖與凋亡的重要基因，有野生型和突變型兩種分型。野生型P53基因存在于人體正常細(xì)胞中，是一個(gè)非常重要的抑癌基因。其作用機(jī)制為與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，抑制細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(CDK)活性，使細(xì)胞停滯在G1期或引起細(xì)胞程序性死亡〔5〕。野生型P53半衰期短，免疫組織化學(xué)難以檢測。當(dāng)機(jī)體細(xì)胞受到物理、化學(xué)因素刺激或自身機(jī)體的改變后，野生型P53基因發(fā)生自身空間結(jié)構(gòu)改變，轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗?即突變型P53)，失去了抑制CDK活性的功能，失去了調(diào)控機(jī)體細(xì)胞增殖、凋亡和DNA修復(fù)的作用，進(jìn)而失去了抑制腫瘤形成的生物學(xué)特性，且進(jìn)一步促進(jìn)了機(jī)體細(xì)胞增殖及惡性轉(zhuǎn)化〔6〕，因此，可將突變型P53作為判斷結(jié)直腸癌浸潤、轉(zhuǎn)移能力的指標(biāo)之一。由于突變型P53蛋白具有不易水解、半衰期長的特性，目前S-P免疫組化法檢測到的均為突變型P53。本研究結(jié)果示，P53蛋白表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，而癌旁正常黏膜幾乎未見P53的陽性表達(dá)，與溫玉婷等〔7〕報(bào)道結(jié)果基本相符。P53基因可能成為結(jié)直腸癌治療的另一個(gè)重要藥物靶點(diǎn)。有學(xué)者提出以下理論策略，干預(yù)P53與MDM2的相互作用、降解突變型P53蛋白、抑制突變P53下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、RNA干擾突變P53表達(dá)、恢復(fù)突變P53構(gòu)象等〔8〕。目前還沒有相應(yīng)靶向藥物應(yīng)用于臨床。

Ki-67是由MKI-67基因編碼的核蛋白，是一種核基質(zhì)，為DNA復(fù)制提供場所，并參與染色體支架的組成，具有非組蛋白的特點(diǎn)，其功能與細(xì)胞有絲分裂密切相關(guān)〔9〕，在G1后期出現(xiàn)，在S、 G2期逐漸上升，至M期達(dá)到高峰，細(xì)胞有絲分裂后迅速減少，在G0期不表達(dá)，是表示細(xì)胞增殖程度的一項(xiàng)可靠指標(biāo)。目前，有關(guān)Ki-67表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的生物學(xué)行為之間的關(guān)系尚未達(dá)成共識。趙巖等〔10〕研究顯示，Ki-67蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性。而李偉等〔11〕研究顯示，Ki-67蛋白在直腸癌中的過表達(dá)與腫瘤Dukes分期、組織學(xué)分化程度等臨床病理參數(shù)無明顯相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，Ki-67在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，隨腫瘤細(xì)胞分化程度降低、TNM分期增高及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，Ki-67的表達(dá)指數(shù)明顯增高。Ki-67表達(dá)水平能反映腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)，可作為判斷結(jié)直腸癌生物學(xué)行為的一項(xiàng)指標(biāo)。關(guān)于Ki-67蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后關(guān)系的不同報(bào)道，可能是由于樣本數(shù)量、實(shí)驗(yàn)評判標(biāo)準(zhǔn)或地域差異性有關(guān)，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量深入探討。

關(guān)于P53、EGFR和Ki-67在結(jié)直腸癌中的表達(dá)，我國已有單項(xiàng)或兩項(xiàng)小樣本研究，尚缺乏關(guān)于三者同時(shí)表達(dá)的研究報(bào)道。本組研究結(jié)果提示三者均參與了腫瘤細(xì)胞的無限增殖，隨腫瘤進(jìn)展其陽性表達(dá)率增高，三者之間可能存在一定關(guān)聯(lián)。EGFR/PI3K/Akt信號通路可以通過激活CDK4來抑制P21Cipl和P27 Kip2(P21和P27為CDK抑制蛋白)的表達(dá)，使其在胞質(zhì)中堆積而無法與CDK連接，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞由G1期向S期進(jìn)展，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展〔12〕；突變型P53蛋白失去抑制CDK活性，使細(xì)胞腫瘤細(xì)胞無限增殖〔6〕。由此推測，EGFR、P53均可通過調(diào)節(jié)CDK的活性，進(jìn)一步調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖與分化。本研究結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌組織中EGFR與P53表達(dá)呈正相關(guān)。Ki-67核抗原的表達(dá)隨細(xì)胞增殖周期的變化而變化，半衰期短，不易受生長因子誘導(dǎo)，直接反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性。本研究結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌組織中Ki-67與EGFR、P53的表達(dá)無相關(guān)性。近年來，有關(guān)惡性腫瘤的精準(zhǔn)醫(yī)療及個(gè)性化治療的提出，單靶點(diǎn)分子靶向藥物廣泛應(yīng)用于臨床治療，如抗EGFR拮抗劑(如西妥昔單抗、貝伐珠單抗等)的應(yīng)用，晚期結(jié)直腸癌患者的生存期得到了顯著改善，但也存在一些弊端，在RAS基因突變后抗EGFR類藥物的療效不佳〔13〕。由于在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中，有許多基因參與，信號通路之間相互關(guān)聯(lián)，因此多個(gè)基因的聯(lián)合檢測將成為下一步的研究重點(diǎn)。本研究聯(lián)合檢測P53、EGFR和Ki-67有利于對結(jié)直腸癌進(jìn)展、預(yù)后、新輔助及輔助化療的效果進(jìn)行評估，并為結(jié)直腸癌的個(gè)性化治療及分子靶向治療提供科學(xué)依據(jù)。