郭 娜 遠孝瓊 堯陽城 鄧陶然 杜瑤瑤 騰雪梅 李豫峰

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院生殖中心，湖北省武漢市 430000，電子郵箱：tsguona@126.com)

近年來，隨著社會壓力增大、環(huán)境污染加劇、婦女生育年齡推遲以及二胎政策放開，不孕癥患病率逐年上升[1-2]。高齡、卵巢功能減退的不孕患者越來越多[3]，其臨床表現(xiàn)為卵巢刺激反應(yīng)不佳，獲卵數(shù)少，卵母細胞質(zhì)量差，可供移植胚胎數(shù)量及質(zhì)量下降[3-4]。大多數(shù)女性會對移植非優(yōu)質(zhì)胚胎的母嬰結(jié)局感到焦慮，臨床醫(yī)生也可能會對移植非優(yōu)質(zhì)胚胎猶豫不決。人類輔助生殖技術(shù)的理想結(jié)局是單胎健康活產(chǎn)。胚胎質(zhì)量是決定體外受精-胚胎移植成功率的主要預(yù)測指標。目前，很少有研究關(guān)注胚胎質(zhì)量與妊娠結(jié)局、新生兒結(jié)局的相關(guān)性。本研究通過回顧性分析2 593個單囊胚凍融移植周期的臨床資料，以評估胚胎質(zhì)量對妊娠結(jié)局及新生兒結(jié)局的影響，為改進胚胎選擇策略及提高單囊胚凍融周期移植成功率提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2012年1月至2016年12月在我院接受單囊胚凍融移植的2 593個周期的臨床資料。納入標準：(1)夫妻雙方染色體核型正常；(2)單囊胚移植周期；(3)女方宮腔形態(tài)正常，無子宮畸形、宮腔粘連、子宮多發(fā)性內(nèi)膜息肉、子宮內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜結(jié)核，無不良孕產(chǎn)史及反復(fù)流產(chǎn)病史。排除標準：夫妻雙方任一方存在甲狀腺疾病、糖尿病、高血壓等代謝性疾病史。本研究進行單囊胚移植周期的原因如下：(1)新鮮周期移植后僅剩1個符合冷凍標準的囊胚用于冷凍保存；(2)囊胚由于冷凍損傷，復(fù)蘇后僅剩1個存活囊胚可供移植；(3)瘢痕子宮或避免多胎妊娠，復(fù)蘇周期患者僅要求移植1個存活囊胚。采用Gardner囊胚評分體系[5]評估囊胚質(zhì)量，根據(jù)囊胚質(zhì)量不同分為優(yōu)質(zhì)囊胚組1 727個和非優(yōu)質(zhì)囊胚組866個。兩組的女方年齡、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、體質(zhì)指數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度、不孕年限及類型、不孕病因及內(nèi)膜方案比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。本研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，所有患者夫妻雙方均了解并知情同意。

表1 兩組間基礎(chǔ)資料的比較

1.2 囊胚培養(yǎng)及評估 采用常規(guī)體外受精、卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù) (intracytoplasmic sperm injection,ICSI)進行受精，16～18 h后進行觀察，根據(jù)胚胎卵裂情況，于體外受精后第3天挑選1～2個卵裂期胚胎用于新鮮周期移植或冷凍，剩下的胚胎轉(zhuǎn)移至G2囊胚培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，將達到冷凍標準的囊胚進行玻璃化冷凍保存。于體外培養(yǎng)第5、6天對囊胚形態(tài)進行評估，按照Gardner囊胚評分體系[5]根據(jù)囊腔擴張程度對囊胚進行分期：囊腔范圍小于胚胎體積的一半為1期；囊腔范圍超過胚胎體積的一半為2期；囊腔占滿整個胚胎為3期；囊腔完全擴張，透明帶變薄為4期； 囊胚開始孵化為5期；囊胚完全孵出為6期。3期及以上的囊胚，則進一步對囊胚內(nèi)細胞團(inner cell mass，ICM)和滋養(yǎng)外胚層(trophectoderm，TE)進行評級。ICM評級標準[5]：A級為ICM細胞數(shù)多，緊密成團，清晰可見；B級為ICM細胞數(shù)少，排列松散；C級為ICM細胞數(shù)極少，幾乎沒有，不清晰。TE評級標準[5]：A級為TE細胞數(shù)多，呈鐮刀形連續(xù)平鋪；B級為TE細胞數(shù)少，排列松散；C級為TE細胞數(shù)極少，幾乎沒有，不清晰。冷凍標準：于囊胚培養(yǎng)第5、6天觀察囊胚形態(tài)，若囊胚在3期及以上，且ICM或TE評級在B級以上，其中3BB及以上的囊胚為優(yōu)質(zhì)囊胚，而AC/BC/CA/CB囊胚為非優(yōu)質(zhì)囊胚。

1.3 囊胚冷凍及復(fù)蘇程序 本研究所用冷凍液、載桿、復(fù)蘇液均購自日本KITAZATO生物制藥有限公司。按照本中心常規(guī)步驟進行囊胚冷凍復(fù)蘇[6]。復(fù)蘇后的囊胚均置入37℃的COOK桌面培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 h后觀察囊胚色澤及囊胚腔是否重新擴張，囊腔部分或全部擴張為存活，進行移植。

1.4 內(nèi)膜準備方法 (1)自然周期：于患者月經(jīng)周期第10～12天采用B超監(jiān)測卵泡及內(nèi)膜，排卵當(dāng)日查血黃體生成素、雌二醇、孕激素水平，于排卵后4～5 d進行凍融囊胚移植。(2)人工周期：按遞增法口服戊酸雌二醇(補佳樂，德國拜耳制藥)，服用方法為月經(jīng)第2～4天2 mg/d(1次/d),第5～8天2 mg/d(2次/d),第9～12天3 mg/d(2次/d),根據(jù)內(nèi)膜厚度調(diào)整用藥量及時間。當(dāng)內(nèi)膜厚度達到7 mm及以上且雌激素作用時間不少于10 d時，給予黃體酮轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，在轉(zhuǎn)化的第6天進行囊胚解凍。

1.5 移植后的支持治療 黃體支持方案有兩種：(1)黃體酮陰道緩釋凝膠(默克雪蘭諾公司，規(guī)格：90 mg/支)，90 mg/次，1次/d，置于陰道；并口服地屈孕酮(蘇威制藥廠，規(guī)格：10 mg/片)，10 mg/次，2次/d。移植后繼續(xù)給藥至12 d驗血。(2)黃體酮軟膠囊(法國法杏大藥廠，規(guī)格：100 mg/粒)，200 mg/次，1次/d，置于陰道；并口服地屈孕酮，20 mg/次，2次/d。移植后繼續(xù)給藥至12 d驗血。

1.6 妊娠及新生兒結(jié)局的評估 (1)著床：囊胚移植4～6周行陰道B超可見到孕囊數(shù)目。著床率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%。(2)臨床妊娠：囊胚移植后12 d查血β人絨毛膜促性腺激素陽性，且移植后4～6周行陰道B超可見孕囊，包括宮外孕。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/總移植周期數(shù)×100%。(3)早期流產(chǎn)：妊娠后于12周前終止為早期流產(chǎn)。早期流產(chǎn)率=早期流產(chǎn)周期數(shù)/總移植周期數(shù)×100%。(4)異位妊娠：囊胚在子宮腔以外著床。異位妊娠率=異位妊娠周期數(shù)/總移植周期數(shù)×100%。(5)活產(chǎn)：胎兒娩出后至少具有以下一項生命體征，包括心跳、呼吸、臍帶搏動、隨意肌收縮?；町a(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/總移植周期數(shù)×100%。(6)多胎妊娠：移植后早孕期B超見到2個及以上的孕囊。多胎妊娠率=多胎妊娠周期數(shù)/總移植周期數(shù)×100%。(7)引產(chǎn)：因發(fā)現(xiàn)胎兒畸形、母親嚴重妊娠并發(fā)癥而不能繼續(xù)妊娠或其他原因(不包括死胎)人為終止妊娠。引產(chǎn)率=引產(chǎn)周期數(shù)/總移植周期數(shù)×100%。(8)母體并發(fā)癥：主要包括妊娠期高血壓疾病、妊娠期糖尿病、胎膜早破、前置胎盤等。(9)低出生體重兒：出生體重小于2 500 g。(8)極低出生體重兒：出生體重小于1 500 g。(10)巨大兒：出生體重大于4 000 g。(11)早產(chǎn)：活產(chǎn)周期中，滿20周至37周前分娩。(12)出生缺陷：在出生時或出生以后表現(xiàn)的結(jié)構(gòu)、功能或發(fā)育異常，可能是由出生前遺傳或非遺傳因素造成。(13)圍生期死亡兒：死產(chǎn)及胎兒娩出后早期新生兒死亡。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，比較采用兩獨立樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以[M(P25，P75)]計數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組的妊娠結(jié)局比較 優(yōu)質(zhì)囊胚組有1 288個(74.58%)常規(guī)體外受精周期和439個(25.42%)ICSI周期，非優(yōu)質(zhì)囊胚組有604個(69.75%)常規(guī)體外受精周期和262個(30.25%)ICSI周期，優(yōu)質(zhì)囊胚組常規(guī)體外受精比例高于非優(yōu)質(zhì)囊胚組，ICSI比例低于非優(yōu)質(zhì)囊胚組(χ2=6.833，P=0.009)。優(yōu)質(zhì)囊胚組著床率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率均高于非優(yōu)質(zhì)囊胚組(均P<0.05)，而兩組間異位妊娠率、早期流產(chǎn)率、多胎妊娠率、引產(chǎn)率及母體并發(fā)癥發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表2。優(yōu)質(zhì)囊胚組共9個周期引產(chǎn)，其中4例因胎兒畸形(腎臟畸形1例、脊柱畸形1例、心臟畸形1例、唇腭裂1例)引產(chǎn)，2例因染色體異常引產(chǎn)，另外3例因孕中期胎死宮內(nèi)而引產(chǎn)；非優(yōu)質(zhì)囊胚組共4個周期引產(chǎn)， 其中2例因胎兒畸形(唇腭裂1例，腦部結(jié)構(gòu)發(fā)育異常1例)引產(chǎn)，1例胎膜早破而引產(chǎn)，1例重度子癇而引產(chǎn)。

表2 兩組間妊娠結(jié)局的比較[n(%)]

注：優(yōu)質(zhì)囊胚組的27個多胎妊娠周期中，中途流產(chǎn)15個，最終只有12個雙胎活產(chǎn)周期；非優(yōu)質(zhì)囊胚組的6個多胎妊娠周期均在中途流產(chǎn)。

2.2 兩組新生兒一般情況及結(jié)局比較 優(yōu)質(zhì)囊胚組有12個雙胎妊娠活產(chǎn)周期(其中8個為男性雙胎，4個為女性雙胎)，非優(yōu)質(zhì)囊胚組無雙胎活產(chǎn)周期。本研究僅比較兩組間單胎妊娠的新生兒結(jié)局。優(yōu)質(zhì)囊胚組男性新生兒比例高于非優(yōu)質(zhì)囊胚組(P<0.05)，兩組間新生兒分娩方式、出生時孕周、出生體重以及早產(chǎn)兒比例、低出生體重兒比例、極低出生體重兒比例、巨大兒比例、圍生期死亡兒比例、出生缺陷發(fā)生率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表3。優(yōu)質(zhì)囊胚組單胎妊娠新生兒有3例出生缺陷，包括心臟發(fā)育不良1例、女嬰卵巢囊腫1例、軟腭裂1例；非優(yōu)質(zhì)囊胚組單胎妊娠新生兒有2例出生缺陷，包括Turner綜合征1例、左心室未閉合1例。

表3 兩組單胎妊娠新生兒一般情況及結(jié)局的比較

3 討 論

目前，在世界范圍內(nèi)每6對夫妻中就有一對受到不孕癥的影響，這影響了家庭穩(wěn)定及社會和諧。自1978年世界上第1例試管嬰兒誕生以來，人類輔助生殖技術(shù)獲得了突飛猛進的發(fā)展，給許多不孕癥患者家庭帶來了福音。但是，伴隨著床率提高的同時，醫(yī)源性多胎妊娠已經(jīng)成為人類輔助生殖技術(shù)最常見的并發(fā)癥之一。單胚胎移植被認為是減少多胎妊娠的最佳方法，而胚胎質(zhì)量則是影響單胚胎移植成功率的主要因素。有學(xué)者認為胚胎質(zhì)量與著床率、臨床妊娠率相關(guān)[7]，而其與產(chǎn)科結(jié)局和新生兒結(jié)局的關(guān)系卻尚不清楚。移植不同質(zhì)量的胚胎對母嬰結(jié)局的影響，成為生殖專家及不孕癥患者們共同關(guān)注的問題。

成功的人類輔助生殖技術(shù)妊娠依賴于良好的子宮內(nèi)膜容受性，同時選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進行移植也是影響其結(jié)果的重要因素。有研究表明，移植質(zhì)量較差的胚胎可能會降低臨床妊娠率和活產(chǎn)率[8]，這可能是因為質(zhì)量較差的胚胎具有較高的非整倍體率[9]。本研究通過設(shè)置嚴格的納入、排除標準，排除了移植胚胎個數(shù)和子宮內(nèi)膜容受性等因素，采用凍融周期單囊胚移植模型來研究胚胎質(zhì)量對母體和子代的影響，結(jié)果顯示優(yōu)質(zhì)囊胚組的臨床妊娠率及活產(chǎn)率高于非優(yōu)質(zhì)囊胚組(P<0.05)。這可能與受精方式的不同影響了妊娠結(jié)局有關(guān)：與非優(yōu)質(zhì)囊胚組比較，優(yōu)質(zhì)囊胚組常規(guī)體外受精的比例更高，而ICSI的比例更低(P<0.05)。既往研究表明，ICSI雖然可以改善獲卵數(shù)少的患者的受精率，但并不能提高胚胎利用率、優(yōu)質(zhì)胚胎率[10]。與常規(guī)體外受精過程相比，ICSI將單個精子直接注射到卵母細胞內(nèi)，可能增加了對卵母細胞結(jié)構(gòu)的損傷，同時繞過了卵母細胞對精子自然選擇的屏障，使質(zhì)量差的精子受精，從而影響了胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局。有學(xué)者認為，選擇形態(tài)學(xué)評分較差的胚胎進行移植，一旦達到臨床妊娠，大多數(shù)都可獲得活產(chǎn)，這對于反復(fù)出現(xiàn)胚胎發(fā)育較差的女性而言是不錯的選擇[11]。而在本研究中，移植質(zhì)量較差的囊胚也能獲得33.6%的活產(chǎn)率。

目前，有關(guān)胚胎質(zhì)量對新生兒結(jié)局影響的研究報道較少。有學(xué)者認為，胚胎質(zhì)量對母體及子代健康的影響不應(yīng)忽略不孕因素本身會增加圍生期風(fēng)險，比如早產(chǎn)、低出生體重兒、子癇前期、胎膜早破等，其中卵巢早衰可能會增加母體并發(fā)癥發(fā)生率[7]。而本研究中，不同質(zhì)量胚胎組在母體并發(fā)癥發(fā)生率、分娩方式、孕周、出生體重、早產(chǎn)兒比例、低出生體重兒比例、極低出生體重兒比例、巨大兒比例、出生缺陷發(fā)生率等方面差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Oron等[7]在研究1541例新鮮單胚胎移植周期臨床結(jié)局時發(fā)現(xiàn)，移植質(zhì)量較差的胚胎并未增加圍生期和新生兒不良結(jié)局的發(fā)生率。Nakagawa等[11]在評估移植胚胎質(zhì)量與最終圍產(chǎn)結(jié)局關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，移植質(zhì)量較差的胚胎達到臨床妊娠的可能性雖然低于移植優(yōu)質(zhì)胚胎，但一旦達到臨床妊娠，其獲得活產(chǎn)的概率以及圍生期結(jié)局與移植優(yōu)質(zhì)胚胎者相似，這一研究結(jié)果為只能選擇劣質(zhì)胚胎進行移植的患者提供了良好的心理安慰和有力的數(shù)據(jù)支撐。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果類似，然而局限于本研究的實驗設(shè)計和樣本量，所得結(jié)論需要樣本量更大的前瞻性研究加以驗證。此外本研究中，優(yōu)質(zhì)囊胚組男性新生兒比例高于非優(yōu)質(zhì)囊胚組(P<0.05)，這可能與非優(yōu)質(zhì)囊胚組ICSI比例更高有關(guān)，行ICSI治療的夫婦多為男性不育，其含Y染色體精子的受精能力下降，或含X染色體的精子比含Y染色體的精子更容易優(yōu)先獲得[12]。Huang等[13]利用Timelapse延時攝像系統(tǒng)觀察胚胎發(fā)育動力學(xué)參數(shù)與活產(chǎn)胎兒性別之間關(guān)系，發(fā)現(xiàn)男胚比女胚生長速度快，當(dāng)胚胎冷凍復(fù)蘇時，優(yōu)質(zhì)男胚更容易被選中移植。

綜上所述，單囊胚凍融移植周期中，囊胚質(zhì)量雖然會影響母體妊娠率和活產(chǎn)率，但移植質(zhì)量較差的囊胚并不會增加圍生期不良結(jié)局和新生兒缺陷的發(fā)生率。選擇質(zhì)量差的胚胎進行移植對于反復(fù)出現(xiàn)胚胎發(fā)育較差的女性而言會是不錯的選擇。