候月輝，朱哲，李 覃，趙季紅

(1.天津市武警特色醫(yī)學(xué)中心，心血管重塑與靶器官損傷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300162；2.天津市武警后勤學(xué)院，天津 300309；3.武警后勤學(xué)院病原生物學(xué)教研室，天津 300309；4.天津武警特色醫(yī)學(xué)中心干部病房，天津 300162)

血管內(nèi)皮下低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)的積聚及其氧化修飾是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊形成的重要初始事件，而氧化修飾后的低密度脂蛋白( oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)作為心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素又能通過(guò)多種機(jī)制加速AS的進(jìn)程，如誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、刺激泡沫細(xì)胞形成及促進(jìn)平滑肌細(xì)胞遷移、增殖等[1]，新近研究顯示，ox-LDL還可以刺激中性粒細(xì)胞釋放大量胞外核酸網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)[2]，近年發(fā)現(xiàn)一種與AS有著緊密聯(lián)系的胞外核酸結(jié)構(gòu)，其間結(jié)合有髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、組蛋白、彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)等具有抗菌作用的活性蛋白，除發(fā)揮固有免疫防御功能外，還可通過(guò)促炎、細(xì)胞毒性及促血栓等效應(yīng)參與多種疾病的進(jìn)程[3]，這或許是ox-LDL影響AS的新機(jī)制， 而中性粒細(xì)胞受到刺激釋放NETs的這一行為被稱為NETosis。

曲美他嗪(trimetazidine，TMZ)能夠抑制脂肪酸β氧化、刺激葡萄糖氧化、增加三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的生成效率，臨床上主要用于改善心肌代謝。近年研究發(fā)現(xiàn)，TMZ還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬[4]、抑制氧化應(yīng)激、改善血管炎癥等作用[5]，而自噬被證實(shí)與NETs有著非常緊密的聯(lián)系[6]，提示TMZ或能通過(guò)影響細(xì)胞自噬有效干預(yù)NETs的形成。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，使用TMZ干預(yù)能有效降低AS模型小鼠NETs水平，延緩斑塊進(jìn)展[7]，但對(duì)其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究闡明。本研究正是以此為出發(fā)點(diǎn)，首先通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察ox-LDL對(duì)NETs的誘導(dǎo)作用，而后進(jìn)一步探討TMZ對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)NETs生成的影響及其與細(xì)胞自噬的關(guān)系，為防治AS提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料8周齡健康C57BL/6♂小鼠，購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0002；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、胰酶、D-PBS均購(gòu)自Gibco公司；小鼠中性粒細(xì)胞分離試劑盒(貨號(hào)p8550)購(gòu)自索萊寶公司，Picogreen dsDNA定量試劑盒(P11496)購(gòu)自Invitrogen公司；小鼠抗Ly6G-PE(12-5931-81)、CD11b-PE/Cy7(25-0112-81)抗體購(gòu)自eBioscience公司；兔抗小鼠anti-MPO(ab208670)、anti-LC3b(ab192890)、anti-Beclin-1(ab207612)抗體及山羊抗兔 IgG H&L(Alexa Fuor?R488)抗體(ab208670)均購(gòu)自abcam公司；佛波酯(PMA)(貨號(hào)17673-25.5)購(gòu)自TargetMol公司；ox-LDL(貨號(hào)YB-002)購(gòu)自廣州奕源； 曲美他嗪(貨號(hào)HY-130968)購(gòu)自MCE公司；Rapamycin(貨號(hào)A10782-5)、Ly294002(A10547)購(gòu)自Adooq Bioscience公司。

1.2 方法

1.2.1小鼠骨髓中性粒細(xì)胞分離 脊椎脫臼法處死小鼠，分離股骨與脛骨，剪去骨兩端，PBS沖洗制備骨髓單細(xì)胞懸液，按照中性粒細(xì)胞分離試劑盒說(shuō)明書(shū)，以密度梯度離心法分離提取中性粒細(xì)胞，用體積分?jǐn)?shù)0.5% 胎牛血清的無(wú)酚紅DMEM高糖培養(yǎng)基(以下簡(jiǎn)稱培養(yǎng)基)重懸細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分別取Anti-CD 11b、Anti-Ly6G抗體，根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)操作雙重標(biāo)記細(xì)胞，流式細(xì)胞儀(CytomicsFC500，Beckman Coulter，USA)上機(jī)檢測(cè)中性粒細(xì)胞含量，臺(tái)盼藍(lán)染色評(píng)估細(xì)胞活力。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) ox-LDL 對(duì)細(xì)胞活力的影響 為探討ox-LDL能否在干預(yù)濃度及時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞活力，將細(xì)胞按4×105個(gè)/孔接種于24孔板，培養(yǎng)箱內(nèi)靜置30 min，分別用50、100、200 mg·L-1ox-LDL干預(yù)4h后收集細(xì)胞，200 μL Binding buffer重懸，加入5 μL AnnexinV-FITC避光孵育10 min，收集細(xì)胞再次加入200 μL Binding buffer重懸，加入5 μL PI直接上機(jī)，流式細(xì)胞儀收集6 000個(gè)事件進(jìn)行分析。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 中性粒細(xì)胞按4×105個(gè)/孔接種于24孔板，每孔500 μL，靜置30 min細(xì)胞貼壁后，分別用25、50 、100 、200 mg·L-1的ox-LDL干預(yù)4 h，設(shè)置陽(yáng)性(PMA 100 nmol·L-1)及陰性(培養(yǎng)基)對(duì)照組，另外設(shè)置不同的干預(yù)時(shí)間(ox-LDL 100 mg·L-1干預(yù)0、2、4、6 h)進(jìn)行對(duì)比。成功建立NETs誘導(dǎo)模型后，根據(jù)干預(yù)藥物的不同將細(xì)胞分為對(duì)照組(培養(yǎng)基恒溫孵育4 h)、ox-LDL誘導(dǎo)組(100 mg·L-1ox-LDL刺激4 h)、TMZ+ox-LDL組(10 μmol·L-1TMZ預(yù)處理細(xì)胞30 min后，100 mg·L-1ox-LDL干預(yù)4 h，組內(nèi)另設(shè)1、100 μmol·L-1TMZ濃度組)、Ly294002+ox-LDL組(20 μmol·L-1Ly294002預(yù)處理細(xì)胞30 min后，100 mg·L-1ox-LDL干預(yù)4 h)組、Rapamycin+ox-LDL組(100 nmol·L-1Rapamycin預(yù)處理細(xì)胞30 min后，100 mg·L-1ox-LDL干預(yù)4 h)，各組在37 ℃ CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒濕培養(yǎng)箱中孵育相應(yīng)時(shí)間后進(jìn)行下列觀察檢測(cè)。

1.2.4PicoGreen?dsDNA 定量試劑盒檢測(cè)上清cfDNA/nets水平 各組干預(yù)完后抽取培養(yǎng)液，1 200 r·min-1離心10 min后取上清及配好的標(biāo)準(zhǔn)品 100 μL加入到96孔板,混以稀釋濃度為5 mL·L-1的Picogreen 100 μL，室溫避光孵育5 min 后熒光酶標(biāo)儀(LS55,Perkin Elmer,USA)檢測(cè)熒光值(Ex 480 nm，Em 520 nm，Cut off 515 nm)， 標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為1 000、100、10、1、0 μg·L-1，利用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算各組cfDNA/nets濃度。

1.2.5免疫熒光觀察NETs的形成 上述各組細(xì)胞干預(yù)完后， 4%多聚甲醛固定30 min；PBS浸洗后0.5% Triton X-100溶液室溫通透20 min；再次浸洗后滴入山羊血清室溫封閉30 min；吸去封閉液，一抗(anti-MPO抗體 1 ∶200稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜； PBS清洗后，加入1 ∶1 000稀釋的二抗山羊抗兔 IgG H&L(Alexa Fuor?R488)，室溫孵育1 h；PBS清洗后，DAPI染液避光染色5 min；再次清洗，滴加甘油明膠后，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3b以及髓過(guò)氧化物酶(MPO)的表達(dá)情況 小鼠骨髓中性粒細(xì)胞按照2×106個(gè)/孔接種于6孔板，按上述方案干預(yù)后收集細(xì)胞，RIPA裂解液提取總蛋白，混以1×Loading buffer 100 ℃加熱變性7 min；SDS-PAGE分離等量蛋白后轉(zhuǎn)膜；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉封閉1 h；一抗(anti-MPO、anti-LC3b、anti-Beclin-1均1 ∶2 000稀釋) 4 ℃孵育過(guò)夜；洗膜3次，添加二抗(Goat anti-rabbit IgG HRP-S0001 1 ∶5 000稀釋)室溫下孵育1 h；再次洗膜后ECL發(fā)光液顯影。凝膠成像儀觀察各蛋白表達(dá)情況,結(jié)果采用ImageJ軟件量化分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠骨髓中性粒細(xì)胞分離純度及活性流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，與采用上述方法獲得的小鼠中性粒細(xì)胞的純度約95%(Fig 1A)，DAPI熒光染料標(biāo)記后鏡下可見(jiàn)細(xì)胞核呈分葉狀(Fig 1B)，臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示活細(xì)胞占比95%以上。

2.2 ox-LDL對(duì)中性粒細(xì)胞細(xì)胞活力的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，分別使用50、100、200 mg·L-1ox-LDL干預(yù)中性粒細(xì)胞4 h后，各組細(xì)胞活力(cell viability)并未明顯降低(P>0.05)(Fig 2)，提示采用上述濃度ox-LDL干預(yù)小鼠骨髓中性粒細(xì)胞4 h對(duì)細(xì)胞活力沒(méi)有明顯影響。

Fig 1 Isolation purity of neutrophils from mouse bone marrow

A:Purity of mouse bone marrow neutrophils determined by flow cytometry;B:Fluorescent image of mouse bone marrow neutrophils after stained with DAPI

Fig 2 Effect of ox-LDL on cell viability of

2.3 ox-LDL誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞釋放NETs免疫熒光結(jié)果顯示，ox-LDL以濃度-時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞釋放胞外網(wǎng)狀核酸結(jié)構(gòu)(Fig 3A)，與對(duì)照組(陰性)以及PMA組(陽(yáng)性)對(duì)比結(jié)果證實(shí)，其主要成分為MPO-DNA復(fù)合物(Fig 3B)；PicoGreen?dsDNA試劑盒定量檢測(cè)顯示細(xì)胞上清液中cfDNA/nets含量與ox-LDL干預(yù)的濃度及時(shí)間呈正相關(guān)(Fig 3C)。參照Awasthi等[2]的研究，結(jié)合我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選用ox-LDL 100 mg·L-1刺激中性粒細(xì)胞4 h作為后續(xù)誘導(dǎo)NETs的干預(yù)方式，在此條件下，鏡下觀察約60%中性粒細(xì)胞出現(xiàn)了NETosis，細(xì)胞周圍出現(xiàn)大量特征性網(wǎng)絮狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞上清cfDNA/nets的含量較對(duì)照組明顯增高。

2.4 TMZ抑制ox-LDL對(duì)中性粒細(xì)胞釋放NETs 的誘導(dǎo)PicoGreen定量檢測(cè)結(jié)果顯示，各干預(yù)組細(xì)胞培養(yǎng)上清中cfDNA/nets含量均較對(duì)照組顯著增高(P<0.01)，但各組間存在明顯差異；與ox-LDL誘導(dǎo)組相比，TMZ預(yù)孵30min后再以ox-LDL干預(yù)，上清cfDNA/nets的濃度明顯降低(P<0.01)，鏡下觀察網(wǎng)絮狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，及NETosis的細(xì)胞數(shù)量減少，其程度與TMZ的干預(yù)濃度呈負(fù)相關(guān)；而Rapamycin +ox-LDL組細(xì)胞培養(yǎng)上清中cfDNA/nets含量較誘導(dǎo)組明顯升高(P<0.01)，鏡下可觀察到大量NETs特征性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且出現(xiàn)NETosis的細(xì)胞數(shù)量較誘導(dǎo)組明顯增多，LY294002+ox-LDL組結(jié)果與之相反。見(jiàn)Fig 4。

2.5 TMZ下調(diào)中性粒細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白(LC3b II、Beclin-1)及髓過(guò)氧化物酶(MPO)的表達(dá)水平Western blot結(jié)果顯示，中性粒細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3b II及MPO表達(dá)水平隨ox-LDL誘導(dǎo)濃度增加而升高(Fig 5A)，經(jīng)TMZ預(yù)處理后胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3b II 、Beclin-1及MPO蛋白水平較ox-LDL誘導(dǎo)組明顯降低(P<0.01)，并與TMZ預(yù)處理的濃度呈負(fù)相關(guān)(Fig 5B)；使用Ly294002預(yù)處理組細(xì)胞能夠模擬上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果；而Rapamycin+ox-LDL組細(xì)胞上述蛋白表達(dá)水平較ox-LDL誘導(dǎo)組進(jìn)一步增高(P<0.01)(Fig 5C)。

Fig 3 Formation of NETs from mouse bone marrow neutrophils induced by Ox-LDL

3 討論

現(xiàn)已證實(shí)，NETs能夠參與心血管疾病、血栓性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤以及多種炎癥相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展，包括各類微生物及其成分、促炎因子、佛波醇 (PMA)、一氧化氮、活化的血小板、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)、鈣離子和免疫復(fù)合物在內(nèi)的多種物質(zhì)或因子均可誘導(dǎo)NETs的產(chǎn)生，其中NETs與動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的關(guān)聯(lián)源于研究者們?cè)贏S患者及動(dòng)物模型受損的管腔中檢出高水平NETs標(biāo)志物MPO-DNA復(fù)合物,并證實(shí)血液中NETs含量和AS程度相關(guān)[8-9]，考慮到AS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且影響因素眾多，因此誘導(dǎo)NETs產(chǎn)生的因素以及機(jī)制必然是復(fù)雜的，迄今尚未完全闡明。Awasthi等[2]在體外用人外周血中提取的ox-LDL成功誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞釋放大量NETs的研究，無(wú)疑是對(duì)這一問(wèn)題的重要探索與補(bǔ)充，也為我們建立更加貼近機(jī)體內(nèi)環(huán)境的NETs誘導(dǎo)模型提供了依據(jù)。據(jù)此，本研究以小鼠骨髓中性粒細(xì)胞為研究對(duì)象，利用ox-LDL體外刺激誘導(dǎo)NETs產(chǎn)生 ，通過(guò)免疫熒光及PicoGreen染色法定性、定量評(píng)價(jià)NETs的形成情況，成功建立了NETs的誘導(dǎo)模型。

自噬是真核細(xì)胞中必要的一種自我消化降解過(guò)程，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞中蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的更替，在細(xì)胞生長(zhǎng)代謝、結(jié)構(gòu)重塑等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，而近年來(lái)研究證實(shí)，自噬與NETs的形成密切相關(guān)。NETosis的特征是中性粒細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)的解聚以及核膜的裂解，解聚后的染色質(zhì)與胞質(zhì)中的陽(yáng)離子以及多種抗菌蛋白混合并逐漸形成液泡被釋放到胞外，而Remijsen等[6]發(fā)現(xiàn)，自噬在PMA誘導(dǎo)NETs釋放的液泡化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。另有研究表明，激活自噬能夠促進(jìn)NETs釋放，而下調(diào)細(xì)胞自噬水平能夠抑制NETs產(chǎn)生[8,12]。ox-LDL或許是自噬的有效誘導(dǎo)劑，近期研究表明，ox-LDL可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞發(fā)生自噬進(jìn)而影響其生物學(xué)功能[10-11]。綜上，自噬或許同樣參與了ox-LDL對(duì)NETs的誘導(dǎo)過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，ox-LDL刺激4 h后，中性粒細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3bII表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增高，呈ox-LDL濃度依賴性，并與細(xì)胞中MPO的蛋白表達(dá)及上清cfDNA/nets含量的變化趨勢(shì)一致；使用AKT/mTOR抑制劑Rapamycin預(yù)處理細(xì)胞，能夠進(jìn)一步上調(diào)Beclin-1、LC3bII的蛋白表達(dá)，并使上清cfDNA/nets的含量增高，而采用PI3K/AKT阻斷劑LY294002預(yù)處理細(xì)胞則效果相反，表明自噬在ox-LDL誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞釋放NETs的過(guò)程中發(fā)揮了積極的促進(jìn)作用。

Fig 4 Effects of different interventions on NETs release in neutrophils induced by ox-LDL

近年研究顯示，曲美他嗪(TMZ)可以通過(guò)調(diào)控自噬發(fā)揮作用，不過(guò)對(duì)于其調(diào)控方向尚無(wú)定論，有研究認(rèn)為，TMZ能夠上調(diào)細(xì)胞的自噬水平緩解氧化應(yīng)激引起的損傷、抑制細(xì)胞凋亡而延緩疾病的進(jìn)展[4,13]。而Wu等[14]的研究結(jié)果顯示，TMZ能夠通過(guò)激活A(yù)KT/mTOR通路抑制細(xì)胞過(guò)度自噬，降低心肌缺血再灌注損傷。在本研究中，我們分別采用TMZ、LY294002、Rapamycin干預(yù)NETs的誘導(dǎo)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)使用TMZ預(yù)處理能夠下調(diào)小鼠骨髓中性粒細(xì)胞的自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3bII以及NETs的重要成分MPO的表達(dá)，顯著降低上清cfDNA/nets水平。該作用能夠被PI3K/AKT阻斷劑LY294002所模擬， 而使用AKT/mTOR抑制劑Rapamycin預(yù)處理則效果相反，提示TMZ能夠通過(guò)下調(diào)中性粒細(xì)胞的自噬水平，抑制ox-LDL對(duì)NETs的誘導(dǎo)作用，降低NETs的產(chǎn)生。但是我們課題組前期的另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[15]，采用ox-LDL與RAW264.7巨噬細(xì)胞共孵育24 h，誘導(dǎo)其成為泡沫細(xì)胞后，再以TMZ干預(yù)24 h，能刺激細(xì)胞發(fā)生自噬并釋放胞外核酸網(wǎng)(METs)，一種類似NETs的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。不過(guò)由于兩組實(shí)驗(yàn)所使用的細(xì)胞不同，ox-LDL及TMZ的干預(yù)濃度、時(shí)間、方式差異較大，對(duì)于兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異產(chǎn)生的具體機(jī)制需進(jìn)一步研究闡明，另外，由于目前缺乏有關(guān) METs 的深入研究，因此其與 NETs生物活性的異同之處尚不明確。不過(guò)兩組實(shí)驗(yàn)的差異提示，TMZ對(duì)細(xì)胞自噬的影響是復(fù)雜多重的，不同的干預(yù)方式、干預(yù)時(shí)間對(duì)細(xì)胞的自噬水平及NETs形成的影響可能不同甚至相反，這些都有待我們進(jìn)一步研究探討。

Fig 5 Expression of autophagy markers LC3b, Beclin-1 and protein of MPO in neutrophils

A: Neutrophils were treated with ox-LDL in different concentrations for 4 h; B : Neutrophils were pretreated with TMZ in different concentrations for 30 min and then treated with ox-LDL 100 mg·L-1for 4 h; C: Neutrophils were pretreated with TMZ, LY294002, Rapamycin for 30 min and then treated with 100 mg·L-1ox-LDL for 4 h.*P<0.05 ,**P<0.01vscontrol,##P<0.01vsox-LDL 100 mg·L-1induced group.

綜上所述，ox-LDL能夠以濃度-時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)小鼠骨髓中性粒細(xì)胞釋放NETs，而TMZ能夠通過(guò)下調(diào)中性粒細(xì)胞的自噬水平抑制ox-LDL對(duì)NETs的誘導(dǎo)作用，降低NETs水平。本研究充實(shí)了我們前期的研究成果[7]，從細(xì)胞水平證實(shí)了TMZ對(duì)NETs的調(diào)控作用，為擴(kuò)大TMZ的臨床應(yīng)用范圍提供了一定的理論支持。此外，本研究所闡述的TMZ、ox-LDL與自噬、NETs之間的相互作用及關(guān)系或能為預(yù)防AS提供了一種新的診治策略，比如適當(dāng)?shù)氖褂米允勺钄鄤?，抑制自噬依賴的NETs釋放或許是延緩AS進(jìn)程新的治療方式。需要指出的是，由于NETs與自噬生物學(xué)活性復(fù)雜、影響因素多，對(duì)于TMZ下調(diào)細(xì)胞自噬水平，以及抑制NETs釋放的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究，確切的分子機(jī)制還需要充分闡明，而且評(píng)價(jià)TMZ對(duì)NETs產(chǎn)生的影響以及對(duì)AS的治療作用還需要更深入的基礎(chǔ)及臨床研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在天津市心血管重塑與靶器官損傷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝課題組成員以及實(shí)驗(yàn)室王秀娟、陶燕燕老師和李遠(yuǎn)彬同學(xué)的支持與幫助！)