王順超，歐 潔，孫麗丹，吳紅艷

(三峽大學1. 醫(yī)學院免疫系; 2. 感染與炎癥損傷研究所，湖北 宜昌 443002；3. 泉州師范學院化工與材料學院，福建 泉州 362000)

肺癌是癌癥相關死亡的最常見原因，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占所有肺癌的85%。超過70%的NSCLC患者診斷時已是晚期，預后通常較差。目前，用于治療晚期NSCLC的分子靶向藥物主要有吉非替尼、克唑替尼和貝伐珠單抗等。靶向抑制劑改善了NSCLC患者的預后，然而大多數(shù)患者在一年后出現(xiàn)耐藥[1]。因此開發(fā)新型的靶向抑制劑顯得尤為重要。

多胺(polyamine，PA)是天然存在的多陽離子烷基胺，包括腐胺(putrescine，Put)、精脒(spermidine，Spd)和精胺(spermine，Spm)三類，對于真核生物的正常細胞生長和發(fā)育是必不可少的。在正常生理條件下，細胞內(nèi)多胺含量通過合成和代謝的動態(tài)網(wǎng)絡及轉運系統(tǒng)進行嚴格的調控。這種精確的調控確保將細胞內(nèi)多胺水平保持在正常范圍內(nèi)。研究表明[2-3]，多胺代謝途徑以及細胞生長對多胺的需求在腫瘤細胞中處于失調狀態(tài)，多胺水平的升高與肺癌等多種癌癥的發(fā)生與發(fā)展相關。因此，多胺代謝途徑是腫瘤防治研究的重要方向和藥物設計的合理靶點。

ODC是多胺生物合成的限速酶，在癌前細胞中表達上調，是多種腫瘤的致癌基因[4]。ODC的降解速率是由其終產(chǎn)物多胺通過獨特的自身調控網(wǎng)絡調節(jié)的。這個調控網(wǎng)絡的組成是抗酶AZ與抗酶抑制劑AZIN。目前AZIN存在兩種亞型，其中最主要的是AZIN-1。因此，AZIN-1在腫瘤治療中是理想的分子靶點。本實驗運用計算機輔助藥物設計技術設計和篩選AZIN-1抑制劑，研究AZIN-1小分子抑制劑對非小細胞肺癌A549細胞的增殖、凋亡、周期和多胺代謝的影響。

1 材料

1.1 藥物19號和22號藥物稱取適量19號和22號藥物(見Fig 1)干粉，用DMSO配制成濃度為100 μmol·L-1的藥物母液，分裝后置于-20 ℃冰箱凍存。藥物處理細胞前，用RPMI 1640完全培養(yǎng)基將藥物母液稀釋至所需濃度。

Fig 1 Molecular structure of No.19 and No.22 drug

1.2 細胞系非小細胞肺癌細胞系A549細胞(武漢大學典藏中心)。

1.3 試劑19號和22號藥物(Specs公司, 荷蘭)；二甲亞砜(Sigma公司, 美國)；四季青胎牛血清(無內(nèi)毒素)(浙江天杭)；RPMI 1640細胞培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific公司, 美國)；CCK-8試劑盒(北京索萊寶)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基)；細胞周期檢測試劑盒(江蘇凱基)；BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天)；AZ-1羊抗小鼠一抗(本課題組前期研究制備)；AZIN-1和ODC羊抗兔一抗(Proteintech公司, 美國)；高效液相色譜柱(YMC公司, 日本)。

1.4 儀器CO2恒溫培養(yǎng)箱(上海精學)；多功能酶標儀(Tecan公司, 瑞士)；Bioshine ChemiQ serises 化學發(fā)光成像系統(tǒng)(上海歐翔)；Waters 2695型高效液相色譜儀、2489 UV/Vis檢測儀(Waters公司, 美國)；流式細胞儀(BD公司, 美國)。

2 方法

2.1 CCK-8法檢測A549細胞增殖將對數(shù)生長期的A549細胞接種在96孔板中，每孔含有100 μL培養(yǎng)基和5×103個細胞，放置于CO2恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)24 h。細胞貼壁后，用不同濃度的19號或22號藥物(12.5、25、50、75、100 μmol·L-1)進行處理，各個藥物濃度設置4個復孔，3個時間段(24、48和72 h)。藥物處理完畢后去除培養(yǎng)基，每孔加入110 μL現(xiàn)配的CCK-8工作液(RPMI 1640完全培養(yǎng)基 ∶CCK-8溶液=10 ∶1)。放置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，用多功能酶標儀測定各孔在450 nm處的吸光度(A)。藥物對A549細胞的抑制率計算公式為[(A對照孔-A實驗孔)/(A對照孔-A空白孔)]×100%。

2.2 流式細胞術檢測A549細胞凋亡收集各組藥物處理完畢的A549細胞，室溫下離心(離心條件為2 000 r·min-1、5 min)后，PBS洗滌細胞1次。加入500 μL Binding buffer使細胞懸浮，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI后混勻，室溫避光孵育15 min，PBS再次洗滌細胞1次，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

2.3 流式細胞術檢測A549細胞周期收集各組藥物處理完畢的A549細胞，室溫下離心(離心條件為2 000 r·min-1、5 min)后，PBS洗滌細胞1次。加入500 μL預冷的乙醇溶液(體積分數(shù)為0.7)固定細胞，放置在4 ℃冰箱過夜。染色前用PBS洗滌細胞1次，再加入500 μL現(xiàn)配的PI/RNase A染色工作液(體積比為9 ∶1)染色45 min，用流式細胞儀檢測細胞周期。

2.4 Western blot檢測A549細胞ODC、AZ-1和AZIN-1蛋白的表達收集各組A549細胞，加入適量的RIPA裂解液，在冰上裂解50 min。使用冷凍離心機離心(離心條件為4 ℃、12 000 r·min-1、10 min)后，吸取上清液至EP管中。BCA法測定上清液的總蛋白濃度后，各EP管加入相應體積的5×蛋白上樣緩沖液，加熱煮沸10 min，放入-80 ℃冰箱凍存。樣品經(jīng)過SDS-PAGE膠垂直電泳分離后，切下各目的蛋白條帶，再轉移至PVDF膜。室溫下使用脫脂牛奶溶液(體積分數(shù)為0.05)封閉1.5 h，再加入各目的蛋白對應的一抗，置于4 ℃搖床孵育過夜。一抗孵育完成后，用TBST洗膜3次，每次10 min；再加入對應二抗，室溫搖床孵育1 h，再使用TBST洗膜3次，每次10 min。化學發(fā)光法顯影檢測ODC、AZ-1和AZIN-1蛋白表達。

2.5 HPLC檢測A549細胞內(nèi)多胺含量收集各組A549細胞，加入適量的RIPA裂解液，在冰上裂解50 min。使用冷凍離心機離心(離心條件為4 ℃、12 000 r·min-1、10 min)后，吸取上清液至EP管中，BCA法測定上清液的總蛋白濃度。取適量細胞裂解液，用雙蒸水補足體積至800 μL，加入苯甲酰氯10 μL、1 mmol·L-1內(nèi)標(DAH)20 μL和2 mol·L-1NaOH溶液500 μL，渦旋震蕩30 s，充分混勻反應體系，置于40 ℃水浴中進行反應。20 min后，加入2 mL飽和NaCl溶液終止反應。反應液用適量乙醚萃取三次，通風櫥中揮發(fā)干燥。將樣品用1.5 mL甲醇溶解，使用0.22 μm微孔濾膜過濾至進樣瓶中，通過HPLC進行分析。色譜條件：固定相為YMC色譜柱(150 mm×4. 6 mm, 5 μm)，流動相為乙腈-水(40 ∶60)，流速為1 mL·min-1，檢測波長為254 nm，柱溫為30 ℃。

3 結果

3.1 對A549細胞的增殖的影響用不同濃度的19號和22號藥物(0、12.5、25、50、75、100 μmol·L-1)分別處理A549細胞24、48、72 h后，CCK-8檢測結果見Fig 2。與空白對照組相比，19號藥物對A549細胞的增殖具有顯著的抑制作用(P<0.01)，且抑制率具有濃度依賴性。而22號藥物對A549細胞的增殖無明顯抑制作用。經(jīng)GraphPad Prism 6軟件計算，19號藥物處理A549細胞48 h的IC50為(14.04±0.21) μmol·L-1。因此，后續(xù)實驗中以無藥物處理48 h的A549細胞作為空白對照組，以15 μmol·L-1的19號藥物處理48 h的A549細胞作為實驗組，以15 μmol·L-1的22號藥物處理48 h的A549細胞作為陰性對照組。

3.2 對A549細胞周期的影響用15 μmol·L-119號和22號藥物分別處理A549細胞48 h后，PI單染結果見Fig 3。與空白對照組相比，19號藥物可以明顯減少A549細胞的S期細胞的百分比(P<0.05)，明顯增加G0/G1期細胞的百分比(P<0.05)，即19號藥物使A549細胞阻滯于G0/G1期，而22號藥物對A549細胞周期無明顯影響。

3.3 對A549細胞凋亡的影響用15 μmol·L-119號和22號藥物分別處理A549細胞48 h后，PI/Annexin V-FITC雙染結果見Fig 4。與空白對照組相比，19號藥物能夠使A549細胞的早期凋亡和晚期凋亡細胞百分比明顯增加(P<0.01)，說明19號藥物能夠促進A549細胞發(fā)生凋亡，而22號藥物對A549細胞的凋亡無明顯促進作用。

Fig 2 Proliferation of A549 cells inhibited by

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Fig 3 Effect of No.19 drug on cell cycle of A549

A:Control ( 0 μmol·L-1); B: No.19 drug ( 15 μmol·L-1); C:No.22 drug ( 15 μmol·L-1); D:Percentage of cell distribution.*P<0.05vscontrol group

Fig 4 Effect of No.19 drug on apoptosis

A:Control (0 μmol·L-1); B: No.19 drug (15 μmol·L-1); C:No.22 drug (15 μmol·L-1); D:Apoptosis rate,**P<0.01vscontrol group

3.4 對A549細胞AZIN-1、ODC和AZ-1表達的影響用15 μmol·L-119號和22號藥物分別處理A549細胞48 h后，提取蛋白，Western blot結果見Fig 5。與空白對照組相比，19號藥物能夠明顯抑制AZIN-1和ODC的表達(P<0.01)，并且能夠使AZ-1過表達(P<0.01)，而22號藥物對AZIN-1，ODC和AZ-1的表達無明顯影響。

3.5 對A549細胞多胺水平的影響用15 μmol·L-119號和22號藥物分別處理A549細胞48 h后，提取多胺，HPLC結果見Fig 6。統(tǒng)計分析結果顯示，與空白對照組相比，19號藥物能夠顯著抑制A549細胞內(nèi)腐胺的生成(P<0.01)，并且最終能夠降低細胞內(nèi)總多胺的含量(P<0.01)。

4 討論

研究表明，ODC，AZ和AZIN組成的負反饋調控網(wǎng)絡控制著細胞內(nèi)的多胺水平。細胞內(nèi)高多胺水平可刺激AZ合成，AZ可使ODC失活，并通過26S蛋白酶體靶向作用于ODC進行不依賴泛素的降解。此外，AZ可抑制多胺的攝取。AZIN是與ODC高度同源的蛋白質，但是不具有鳥氨酸脫羧活性，可選擇性地與AZ相互作用，且對AZ的親和力遠遠高于ODC，從而阻止其對ODC和多胺轉運系統(tǒng)的作用。AZIN有效地與ODC競爭AZ，使ODC從ODC-AZ復合物中釋放，抑制AZ的功能，恢復ODC活性，從而增強細胞內(nèi)多胺的生成并促進多胺的攝取，同時促進細胞增殖、轉化和腫瘤發(fā)生。細胞內(nèi)多胺穩(wěn)態(tài)受到了高度調控，而在這一調控中AZIN成為了一種致癌分子[5-9]。

Fig 5 Effect of No.19 drug on expression of proteins related

A: protein levels of AZIN-1, ODC and AZ-1by Western blot; B. amount of protein expression,**P<0.01vscontrol group

Fig 6 Effect of No.19 drug on polyamine content

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

利用計算機輔助藥物設計技術篩選潛在的AZIN-1小分子抑制劑，以AZIN的晶體結構為初始結構，利用Autodock軟件進行虛擬篩選，最終篩選出了一系列的AZIN-1小分子抑制劑。通過分子和細胞水平的實驗研究，結果發(fā)現(xiàn)19號藥物對非小細胞肺癌A549細胞增殖具有明顯的抑制作用，并選擇22號藥物作為本研究的陰性對照藥物。

研究證實，誘導AZIN過表達導致細胞增殖增加，同時ODC活性和腐胺含量也隨之增加[10]；AZIN-1的RNA編輯顯著誘導非小細胞肺癌的惡性進展[11]；通過小干擾RNA下調PC3細胞AZIN的表達能夠降低細胞內(nèi)多胺含量，抑制細胞的增殖[12]。以二氟甲基鳥氨酸為代表的ODC特異性抑制劑，已被證明通過干擾多胺代謝抑制腫瘤生長。然而，其生物利用度較低，并且引起多胺代謝和轉運的代償性上調，使得腫瘤細胞擺脫了ODC抑制劑的生長抑制作用，這些局限性極大地限制了其臨床應用[4]。以此為基礎，本實驗探究了AZIN-1小分子抑制劑對非小細胞肺癌A549細胞的多胺代謝、增殖、凋亡以及周期的影響。

本研究結果說明，19號藥物能夠下調AZIN-1與ODC的表達，且上調AZ-1的表達，降低細胞內(nèi)的總多胺含量，誘導A549細胞發(fā)生G0/G1周期阻滯，促進A549細胞發(fā)生凋亡，有效抑制A549細胞的增殖，這與預期相符。

有研究證實，在A549細胞中使用兩種靶向AZIN的siRNA，可以直接減少AZIN的表達，降低ODC水平和活性，以及增強AZ的活性降低細胞內(nèi)多胺含量[13]。Western blot結果發(fā)現(xiàn)，19號藥物的作用與靶向AZIN的siRNA相符。但是HPLC結果發(fā)現(xiàn)19號藥物能夠降低細胞內(nèi)總多胺的含量，顯著抑制Put的產(chǎn)生，但是能夠升高Spd的含量，并且3個組均沒有Spm的產(chǎn)生，可能與多胺的分解代謝以及轉運系統(tǒng)有關[14-15]。盡管已經(jīng)證明了19號藥物通過靶向AZIN來調控腫瘤細胞內(nèi)的ODC的水平，進而影響細胞增殖，但是不排除19號藥物改變AZIN和AZ的表達，通過不依賴多胺水平的途徑來影響細胞生長。

綜上所述，19號藥物能夠明顯干擾A549細胞的多胺代謝，有效降低多胺水平，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，其作用機制需進一步研究?？傊?，本研究表明AZIN-1的小分子抑制劑在抗非小細胞肺癌藥物開發(fā)研究和臨床應用方面具有潛在價值。