李曉丹，曹貴方，楊宏新，于 建，劉默寧，龍 鑫，魏 巍，李春芳，蘇 紅

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，細(xì)胞生物學(xué)教研室，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010110)

輸卵管作為生殖系統(tǒng)的重要組成，是配子運(yùn)輸通道、受精和早期胚胎發(fā)育的場(chǎng)所，其功能受到雌激素的調(diào)控。輸卵管功能的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致不孕、宮外孕、胚胎發(fā)育異?；虼菩詣?dòng)物生產(chǎn)能力下降等。

S100鈣結(jié)合蛋白A8(S100 calcium binding protein A8，S100A8)和S100鈣結(jié)合蛋白A9(S100 calcium binding protein A9，S100A9)是鈣結(jié)合蛋白S100家族中的重要成員，分子大小約十幾kDa，S100A8和S100A9 基因在染色體位置上相鄰，位于人染色體1q21和小鼠第3號(hào)染色體上的基因簇中，表達(dá)于髓系白細(xì)胞，在內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞中也有表達(dá)，并可分泌到細(xì)胞外[1-3]。S100A8和S100A9蛋白可形成異源二聚體發(fā)揮功能，常稱為鈣防衛(wèi)蛋白(calprotectin)[4]。Baithalu等[5]的研究發(fā)現(xiàn)S100A8和S100鈣結(jié)合蛋白A12(S100 calcium binding protein A12，S100A12)基因可能對(duì)牛子宮有天然免疫保護(hù)作用；Wang等[6]通過對(duì)豬妊娠期不同時(shí)期和非妊娠子宮內(nèi)膜mRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)S100A8可能在胚胎著床和胚胎發(fā)育中有作用；人血液中S100A8在月經(jīng)周期增殖期高表達(dá)，并在早孕丟失的子宮褪膜和血液表達(dá)升高[7]，以上研究提示S100A8和S100A9可能在女性或雌性哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)中起重要作用，并受到雌激素調(diào)控。目前發(fā)現(xiàn)S100A8和S100A9可參與免疫調(diào)控、抗菌、炎癥、損傷修復(fù)等生理、病理過程[8]，它們?cè)谧訉m、陰道、妊娠期子宮蛻膜等生殖系統(tǒng)有廣泛分布[5-7]，但S100A8和S100A9在輸卵管組織的分布情況，以及它們對(duì)輸卵管功能的影響還知之甚少。輸卵管功能受到雌激素的調(diào)控，雌激素是否通過調(diào)節(jié)輸卵管S100A8和S100A9，進(jìn)而影響輸卵管的功能這更是未知。

本研究通過免疫組織化學(xué)方法測(cè)定間情期綿羊S100A8和S100A9蛋白在輸卵管的表達(dá)情況；體外模擬排卵期高濃度雌激素，通過研究高濃度雌激素對(duì)輸卵管上皮細(xì)胞中S100A8和S100A9表達(dá)的調(diào)控作用，試探討隨雌激素調(diào)控S100A8和S100A9在輸卵管中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、材料和試劑稱量天平(Sartorius，德國)，立式高壓滅菌鍋(TOMY，日本)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo，美國)，倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)，超凈工作臺(tái)，水平離心機(jī)(Hitachi,日本)，低溫離心機(jī)，酶標(biāo)儀(Eppendorf，德國)，凝膠成像分析系統(tǒng)(Gene，美國)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(CFX96 System，Bio-Rad，美國)，激光共聚焦顯微鏡(Nikon, 日本)，恒溫水浴鍋、水平電泳儀、20 μL、1 000 μL和5 000 μL移液器(Eppendorf，德國)，0.22 μm微孔濾膜過濾器(Millipore，美國)、細(xì)胞刮刀、75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶、25 cm2平皿和6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning，美國)、激光共聚焦皿(Nest, 上海)，眼科剪、眼科鑷等均為國產(chǎn)。

青-鏈霉素、DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶-EDTA(No.15140, No.C11330500BT, No.25300,Gibco,美國)，DMEM/F12無酚紅培養(yǎng)基(No.11039-021, Gibco,美國)，胎牛血清(No.SV30087.02, Hyclone,美國)，DNA Marker(DL2000, Gene star,中國)，UltrasensitiveTMSP-超敏試劑盒(No.Kit-9710,福州邁新，中國)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(No.RR047A，Takara，中國)，SYBR Green Realtime PCR Master Mix(No.QPK-201，Toyobo，日本)，總RNA提取試劑盒(No.220011, 上海飛捷，中國)，Rabbit Anti-MRP8 antibody(No.ab180735，Abcam，美國)，Rabbit Anti-S100A9 antibody(No.ab92507, Abcam,美國)，Goat Anti-rabbit IgG/FITC(No.bs-0295G-FITC，博奧森，中國)，Agarose gel(No.16500100，Invitrogen，美國)，17-β-Estradiol(No.E2758，Sigma，美國)。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)綿羊輸卵管組織中S100A8、S100A9蛋白表達(dá)選取處于性成熟且間情期、體格健壯雌性綿羊，屠宰后迅速取出輸卵管存放于含有5倍雙抗PBS緩沖液的無菌樣品瓶中，將樣品瓶放置冰盒內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室取壺腹部進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)及細(xì)胞原代培養(yǎng)。

輸卵管甲醛固定后，經(jīng)過50%～100%乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片(厚度5-6 μm)。烘片，脫蠟至水，PBS沖洗，微波抗原修復(fù)。之后按照福州邁新免疫組化試劑盒說明進(jìn)行過氧化酶阻斷、封閉、一抗孵育(濃度均為1 ∶200)、二抗孵育、生物素-過氧化酶孵育、顯色、HE染色等步驟處理后，切片脫水、透明，鏡下檢測(cè)目的蛋白S100A8和S100A9蛋白在輸卵管組織中的表達(dá)及分布。

1.3 輸卵管上皮細(xì)胞培養(yǎng)取材同1.2，原代培養(yǎng)及傳代參考本實(shí)驗(yàn)室溫世勇等[9]的實(shí)驗(yàn)方法,取傳5代內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 17-β雌二醇對(duì)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞S100A8、S100A9 mRNA表達(dá)的影響

1.4.1實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Quantitative real-time PCR，q-PCR)引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI中GeneBank公布的綿羊S100A8基因、S100A9基因、和管家基因β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)，用NCBI-Primer BLAST設(shè)計(jì)引物，并送交Invitrogen公司合成引物(表1)，引物純化級(jí)別為PAGE級(jí)別。引物通過PCR驗(yàn)證，PCR產(chǎn)物交于Invitrogen公司測(cè)序。

Tab 1 S100A8,S100A9,β-actin primer sequence for amplification

1.4.2RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及q-PCR測(cè)定 利用上海飛捷RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA。測(cè)定每個(gè)樣品OD260/OD280比值和總RNA濃度，RNA通過1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA提取質(zhì)量，質(zhì)量檢測(cè)合格樣品用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

根據(jù)測(cè)得的總RNA濃度確定每個(gè)樣品在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中需要的總RNA量。采用大連寶生物公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行總RNA去除基因組反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

q-PCR反應(yīng)體系按照PCR-mix(Toyobo)12.5 μL，q-PCR Forward Primer(10 μmol·L-1)1 μL，q-PCR Reverse Primer(10 μmol·L-1)1 μL，cDNA RT反應(yīng)液2.5 μL，ddH2O 8 μL配制。三步法進(jìn)行q-PCR，95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，退火60 ℃ 15 s，72 ℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)；65 ℃至95 ℃繪制熔解曲線；4 ℃保存。反應(yīng)同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，即以ddH2O代替樣本cDNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以排除試劑污染。

1.4.317-β雌二醇對(duì)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞的作用 同一批次細(xì)胞消化后傳代至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，待細(xì)胞覆蓋率至85%左右進(jìn)行無血清無酚紅培養(yǎng)基饑餓12 h處理，以盡可能降低血清對(duì)細(xì)胞的影響。參照綿羊雌二醇生理濃度[9-10]，預(yù)添加10-8mol·L-1的17-β雌二醇(17-β-Estradiol, E2)，設(shè)不同處理時(shí)間2、4、6、12 h組，并設(shè)對(duì)照組。處理結(jié)束后用預(yù)冷的無酶PBS快速洗滌細(xì)胞，冰上提取總RNA按照方法1.4.2用于熒光定量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

同上饑餓處理細(xì)胞后，根據(jù)上述雌激素處理不同時(shí)間S100A8和S100A9的表達(dá)變化，選取表達(dá)差異最顯著的時(shí)間點(diǎn)，設(shè)不同E2處理濃度10-6、10-7、10-8、10-9mol·L-1組，并設(shè)對(duì)照組。處理結(jié)束后用預(yù)冷的無酶PBS快速洗滌細(xì)胞，冰上提取總RNA按照方法1.4.2用于熒光定量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 17-β雌二醇對(duì)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞S100A8、S100A9蛋白表達(dá)的影響免疫熒光檢測(cè)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞中S100A8，S100A9蛋白，在最適濃度的雌激素、不同時(shí)間作用下的表達(dá)情況。細(xì)胞培養(yǎng)于激光共聚焦皿，饑餓處理方法同“1.4.3”，參考不同濃度雌激素對(duì)S100A8、S100A9 mRNA表達(dá)的影響，選擇最適濃度的雌激素，設(shè)不同處理時(shí)間3、6、12 h組，并設(shè)對(duì)照組，處理結(jié)束后PBS清洗，冰丙酮固定，-20 ℃保存待用。

保存的細(xì)胞爬片經(jīng)過Triton X-100通透、BSA封閉、孵育一抗(1 ∶200)、孵育二抗(1 ∶200)、DAPI核染等操作(每步操作后需用PBST清洗)，封片后激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組比較采用單因素方差分析。進(jìn)行兩個(gè)變量相關(guān)性分析，以皮爾森相關(guān)系數(shù)表示，r值為相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 S100A8及S100A9蛋白在綿羊輸卵管的表達(dá)及分布經(jīng)免疫組織化學(xué)SP法染色后，結(jié)果顯示間情期綿羊輸卵管壺腹部S100A8和S100A9蛋白的表達(dá)及分布情況，圖中棕色為陽性反應(yīng)，S100A8和S100A9均在輸卵管黏膜上皮細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，并在腺上皮中也為陽性表達(dá)，同時(shí)在血管中也有表達(dá)(Fig 1)。

2.2 17-β雌二醇對(duì)輸卵管上皮細(xì)胞S100A8及S100A9 mRNA表達(dá)的影響

2.2.1RNA質(zhì)量驗(yàn)證及熒光定量引物驗(yàn)證 細(xì)胞提取總RNA每個(gè)樣品OD260/OD280比值均在1.8～2.1，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證無降解，有28S和18S條帶(Fig 2a)。合成引物經(jīng)驗(yàn)證，克隆的片段條帶清晰且單一，并符合預(yù)期大小(Fig 2b),克隆產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序并將序列進(jìn)行比對(duì)，可與目的基因匹配，說明引物設(shè)計(jì)成功，產(chǎn)物為目的基因。

2.2.2輸卵管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)及建系 綿羊輸卵管上皮細(xì)胞進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞呈多角形，鋪路石狀生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)飽滿，并可以穩(wěn)定傳代，傳代4代左右細(xì)胞活性及細(xì)胞形態(tài)與原代細(xì)胞相比無明顯變化。

2.2.3雌激素作用下S100A8及S100A9表達(dá)與時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化 在17β-雌二醇的作用下，綿羊輸卵管上皮細(xì)胞S100A8及S100A9 mRNA的表達(dá)量，隨著時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化如圖所示(Fig 3)。S100A8在雌激素作用后2 h及4 h后變化不顯著，而在6 h后達(dá)到高峰(P<0.01)，在12 h后顯著降低并低于對(duì)照組(P<0.05)。S100A9在雌激素作用2 h后有顯著降低，之后逐漸升高，在6 h到達(dá)高峰(P<0.01)，12 h后顯著降低并低于對(duì)照組(P<0.01)。

Fig 1 Immunohistochemical staining of oviduct ampulla

a. S100A8 negative control; b/c: S100A8 expressed in mucous epithelial cells and blood vessels of the ampulla；d: S100A9 negative control e/f: S100A9 expressed in mucous epithelial cells and glandular epithelial cells of the ampulla

Fig 2 Agarose gel electrophorogram

A: Total RNA electrophorogram; B: PCR products of S100A8, S100A9, β-actin electrophorogram

2.2.4不同濃度雌激素對(duì)S100A8及S100A9表達(dá)的影響 在不同濃度的17β-雌二醇作用6 h后(根據(jù)“2.2.3”的結(jié)果，此時(shí)表達(dá)量最高)，S100A8及S100A9表達(dá)情況如圖所示(Fig 4)。E2濃度為10-7mol·L-1時(shí)S100A8及S100A9表達(dá)量均為最高(P<0.01)，并且S100A8及S100A9的表達(dá)量在10-7mol·L-1組與10-8mol·L-1組之間均無顯著差異，10-6mol·L-1組與10-9mol·L-1組表達(dá)量較低但均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。所以用10-8mol·L-1E2預(yù)處理細(xì)胞是可行的，在此濃度下S100A8及S100A9均高表達(dá)。

2.2.5輸卵管上皮細(xì)胞S100A8及S100A9基因的相關(guān)性 將S100A8及S100A9 mRNA表達(dá)量做兩個(gè)變量的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示S100A8及S100A9兩個(gè)基因隨著雌激素不同作用時(shí)間，表達(dá)呈極顯著相關(guān)(P<0.01)，r=0.806；S100A8及S100A9兩個(gè)基因在不同雌激素濃度下，表達(dá)呈極顯著相關(guān)(P<0.01)，r=0.919。說明S100A8及S100A9兩個(gè)基因功能上可能相關(guān)。

Fig 3 Expression of S100A8 and S100A9 mRNA at different time points after E2

A:The expression of S100A8 mRNA in oviduct epithelial cells treated with E2for 2 h, 4 h, 6 h,12 h and control; B:The expression of S100A9 mRNA in oviduct epithelial cells treated with E2for 2 h, 4 h, 6 h,12 h and control.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.3 17-β雌二醇對(duì)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞S100A8、S100A9蛋白表達(dá)的影響輸卵管上皮細(xì)胞在10-8mol·L-1濃度(參考“2.2.4”結(jié)果選擇最適濃度)的E2處理不同時(shí)間后，經(jīng)免疫熒光檢測(cè)，S100A8、S100A9蛋白的表達(dá)情況如圖所示(如Fig 5)。S100A8蛋白在E2作用3 h后略高于對(duì)照組，6 h后表達(dá)明顯高于對(duì)照組，熒光增強(qiáng)，這與q-PCR結(jié)果相似。S100A9蛋白在3 h后與對(duì)照組相比沒有明顯改變，6 h后可以發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞表達(dá)有所上升，熒光強(qiáng)度略有增強(qiáng)，q-PCR也同樣顯示6 h后S100A9的表達(dá)升高。

3 討論

輸卵管的功能可受到雌激素的巨大影響，隨著雌激素的變化，可引起輸卵管黏膜在細(xì)胞及分子水平的改變，進(jìn)而影響輸卵管的功能[11]。

Fig 4 Expression of S100A8 and S100A9 mRNA at different concentrations of

A:The expression of S100A8 mRNA in tubal epithelial cells treated with different concentrations of estrogen (10-6, 10-7, 10-8, 10-9mol·L-1) and control;B:The expression of S100A9 mRNA in tubal epithelial cells treated with different concentrations of estrogen(10-6, 10-7, 10-8, 10-9mol·L-1) and control.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 5 Expression of S100A8 and S100A9 proteins at different time points after estrogen treatment by immunofluorescence;

有研究顯示牛輸卵管中發(fā)現(xiàn)有S100A8和S100A9的表達(dá)，并可能參與年齡老化[12]，但該研究并沒有明確S100A8和S100A9的組織分布，并且認(rèn)為它們與病理情況相關(guān)。然而S100A8和S100A9具有天然免疫作用已被多次證實(shí)[8]，Baithalu等[5]發(fā)現(xiàn)S100A8及S100A12在牛的子宮內(nèi)膜高表達(dá)可能更利于牛子宮的健康，我們也通過檢測(cè)健壯的間情期綿羊輸卵管中S100A8和S100A9的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)健康的綿羊輸卵管黏膜上皮內(nèi)膜上皮中均高表達(dá)S100A8和S100A9，并且在輸卵管腺上皮也高表達(dá)，所以S100A8和S100A9應(yīng)該是正常生理環(huán)境下生殖道調(diào)控的重要組成，它們可能通過分泌進(jìn)入管腔，并對(duì)生殖道起到天然防御作用。

這種基礎(chǔ)性的表達(dá)可能受到雌激素的影響。在乳腺癌組織中S100A8和S100A9的表達(dá)受到雌激素受體抑制劑他莫昔芬(tamoxifen)的調(diào)控，并且S100A9在雌激素受體(estrogen recepter, ER)ER+組織中的表達(dá)明顯高于ER-組織[13]；人血液中S100A8在月經(jīng)周期增殖期高表達(dá)，并在早孕丟失的子宮蛻膜和血液表達(dá)升高[7]。雖然以上研究是基于癌組織或血液，但我們?cè)谳斅压芗?xì)胞中也同樣發(fā)現(xiàn)S100A8和S100A9的表達(dá)可受到雌激素的調(diào)控，這種調(diào)控可能來源于生理性變化或雌激素藥物。本研究發(fā)現(xiàn)在體外高濃度雌激素作用下S100A8和S100A9 mRNA均在雌激素作用6 h表達(dá)出現(xiàn)峰值，并且兩個(gè)基因表達(dá)變化顯著相關(guān)。已知在排卵前期，雌激素表達(dá)會(huì)達(dá)到最高峰，我們模擬雌激素高峰期，能夠促進(jìn)輸卵管上皮細(xì)胞S100A8和S100A9 的高表達(dá)，這可能與排卵期交配前后輸卵管對(duì)病原體的防御機(jī)制有關(guān)，并且這種防御功能可能需要這兩個(gè)基因協(xié)同作用。

另外，雌激素對(duì)卵子在輸卵管的配子運(yùn)輸有促進(jìn)作用，而雌激素作用后S100A8和S100A9 的高表達(dá)是否與排卵和卵子運(yùn)輸有關(guān)？最近有研究顯示S100A8在卵母細(xì)胞表達(dá)，認(rèn)為S100A8可能作為卵母細(xì)胞化學(xué)趨化因子之一促進(jìn)顆粒細(xì)胞向卵母細(xì)胞的定向遷移，在原始卵泡形成中起作用[14]。如果S100A8對(duì)顆粒細(xì)胞有趨化作用，排卵前雌激素生理高峰或雌激素藥物引起輸卵管壺腹部上皮細(xì)胞S100A8和S100A9 的高表達(dá)，這可能在排卵時(shí)有助于吸引顆粒細(xì)胞(卵丘細(xì)胞)-卵細(xì)胞復(fù)合體向輸卵管壺腹部的運(yùn)輸。

雌激素可調(diào)控輸卵管的微環(huán)境，雌激素可能通過調(diào)控管腔內(nèi)分泌蛋白S100A8及S100A9對(duì)生殖道天然免疫具有調(diào)控作用，不僅如此，雌激素可能通過它們而影響排卵。了解雌激素對(duì)輸卵管的微環(huán)境的影響，并進(jìn)一步關(guān)注S100A8及S100A9對(duì)輸卵管功能的影響及其分子機(jī)制，這對(duì)于動(dòng)物的生殖調(diào)控或人類輸卵管疾病的治療、輔助生殖技術(shù)的改進(jìn)等可能具有重要意義。