孫承艷，賈 寧，韓 錕

(錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121001)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種發(fā)生于中老年的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。研究報道[1]AD海馬神經(jīng)元有自噬功能障礙，表現(xiàn)為自噬體的成熟、轉(zhuǎn)運及自噬溶酶體形成障礙，導致自噬體大量堆積。Aβ沉積被認為是AD的發(fā)病的核心和“始動”因素，自噬是細胞內(nèi)清除Aβ的重要形式和途徑。細胞內(nèi)mTOR信號通路異常會導致自噬功能障礙。改善腦自噬功能障礙進而減少Aβ沉積成為AD治療的方向，但相關藥物的開發(fā)仍有限。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是綠茶的一種主要多酚成分，占茶多酚制品的40%～50%。研究表明[2-5]，EGCG具有很強的抗氧化、神經(jīng)元保護等功效，是抗氧化作用最強的自由基清除劑之一。因此本文以APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠為對象，研究了EGCG對此動物模型腦自噬功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 8月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠24只，同月齡同背景C57BL/6J小鼠8只，購自中國醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SYXK(遼)2008-005。

1.1.2主要試劑 EGCG(純度>95%)購于Sigma公司； mTOR多克隆抗體購于北京中杉金橋公司；兔抗ULK1抗體、兔抗P62抗體、兔抗LC3Ⅱ/LC3Ⅰ抗體購于北京博奧森生物技術有限公司；Aβ1-42ELISA試劑盒購于Invitrogen公司。

1.1.3儀器 Morris水迷宮安徽正華生物儀器設備有限公司；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)美國bio-rad公司；石蠟切片機德國Leica；紫外分光光度計德國Biophotometer。

1.2 方法

1.2.1動物分組與處理 將APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分成3組，即模型組(transgenic，Tg)、EGCG低劑量組(Tg/EGCG-L)和EGCG高劑量組(Tg/EGCG-H)，對照組(nontransgenic type，NT)為同月齡同背景C57BL/6J小鼠，每組小鼠8只。給藥方法：NT組和Tg組每天給予雙蒸水0.15 mL灌胃，Tg/ EGCG -L組和Tg/ EGCG -H 組分別每天給予EGCG 2 mg·kg-1、6 mg·kg-10.15 mL灌胃，均給藥4周。

1.2.2Morris水迷宮試驗進行行為學檢測 給藥結(jié)束24 h后行Morris水迷宮實驗，實驗分為定位航行實驗和空間探索實驗兩部分，實驗程序參照Morris等方法進行[6]，檢測各組小鼠的空間學習記憶能力。

1.2.3Western blot檢測ULK1、P62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表達 提取各組小鼠海馬的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，40 μg蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5%牛奶封閉，一抗(ULK1，1 ∶500；P62，1 ∶500；LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，1 ∶500；GAPDH，1 ∶5 000)4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗常溫孵育1 h。ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光，Image J軟件分析。

1.2.4免疫組化方法檢測mTOR蛋白表達 提取小鼠右半腦組織于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋制備切片，切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水。0.1 mmol·L-1檸檬酸鹽緩沖液高壓熱修復抗原，滴加血清封閉液。一抗(mTOR多克隆抗體，1 ∶100)4 ℃孵育過夜。滴加生物素標記的二抗，37 ℃孵育1 h。應用DAB顯色試劑盒顯色。顯微鏡下觀察染色呈現(xiàn)出淡棕黃色后，用ddH2O沖洗中止顯色反應。用光學顯微鏡觀察每個視野中陽性細胞表達，每組實驗小鼠切片隨機選取海馬區(qū)3個視野，用Image-Pro Plus v6.0圖像分析軟件分別測定每張切片內(nèi)表達陽性蛋白神經(jīng)元的整合光密度值。

1.2.5ELISA法檢測海馬Aβ1-42水平 將各組小鼠的腦組織稱重，加入8倍體積的鹽酸胍裂解液研磨，室溫下靜置3-4 h。用反應緩沖液1 ∶50稀釋樣品，離心20 min、取上清用于可溶性Aβ1-42的測定，離心管底部沉淀再用 70%甲酸溶解，離心1 h，收集上清液用于不可溶性Aβ1-42的測定。取標準品按說明書建立標準曲線。將標準品、樣品各50 μL分別加入微量酶標板內(nèi)，立即向每孔加入50 μL Aβ42抗體，置搖床室溫孵育3h。反復洗板4次，室溫孵育30 min。每孔加100 μL染液覆蓋，37 ℃孵育30 min。取出酶標板，每孔加終止液100 μL，輕輕混勻，直至孔中的液體由藍變黃?？瞻卓渍{(diào)零，30 min內(nèi)在450nm波長讀取光密度(OD值)，根據(jù)曲線方程，求出腦組織中Aβ1-42的濃度。

2 結(jié)果

2.1 EGCG改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學習記憶能力各組小鼠定位航行試驗(Fig 1A，1B)，顯示尋找平臺逃避潛伏期及平均路程隨著測試時間的延長逐漸縮短。Tg組小鼠逃避潛伏期和尋找平臺平均路程延長 (P<0.05)；經(jīng)EGCG治療后均明顯縮短 (P<0.05)，表明APP/PS1小鼠具有明顯的空間學習障礙，EGCG可以改善其能力。空間探索試驗結(jié)果(Fig 2)顯示，Tg組小鼠穿梭原平臺所在象限次數(shù)明顯減少 (P<0.05)，經(jīng)EGCG治療后次數(shù)均明顯增加 (P<0.05)，提示APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的空間記憶再現(xiàn)能力減低，EGCG可改善其能力。

Fig 1 Spatial learning and memory assessed by measurement of escape latency(A)and path length

#P<0.05vsNT;*P<0.05vsTg

Fig 2 Number of times entered target zone in

#P<0.05vsNT;*P<0.05vsTg

2.2 EGCG調(diào)節(jié)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬mTOR活性各組小鼠海馬CA1區(qū)均可見胞質(zhì)呈棕黃色的mTOR陽性表達細胞(Fig 3)。與NT組比較，Tg組小鼠海馬mTOR蛋白表達陽性神經(jīng)元增多、整合光密度值明顯升高(P<0.05)，提示APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠存在自噬功能障礙；與Tg組比較，Tg/EGCG-L組和Tg/ EGCG -H組小鼠海馬mTOR表達陽性神經(jīng)元減少，mTOR蛋白表達整合光密度值降低(P<0.05)，提示APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)EGCG治療后腦自噬功能改善。

Fig 3 Levels of mTOR in APP/PS1 mice reduced by

#P<0.05vsNT;*P<0.05vsTg

2.3 EGCG改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬神經(jīng)元自噬功能Western blot結(jié)果顯示(Fig 4)，與NT組比較，Tg組小鼠海馬ULK1蛋白表達較明顯減少、P62蛋白表達明顯增加、LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白表達明顯增加 (P<0.05)，提示APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)存在自噬啟動受阻、自噬活性明顯下降及自噬體大量堆積等自噬功能障礙。與Tg組相比Tg/EGCG-L組和Tg/EGCG-H組小鼠海馬ULK1蛋白表達明顯增加、P62蛋白表達減少、LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白表達減少(P<0.05)，提示了EGCG可以促進APP/PS1小鼠海馬內(nèi)的自噬啟動，提高自噬活性，減少自噬體堆積，提高自噬通量，從而減輕自噬功能障礙。

2.4 EGCG減輕APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ1-42水平ELISA結(jié)果顯示(Fig 5A、5B)，Tg組小鼠海馬可溶性Aβ1-42含量及不可溶性Aβ1-42含量(69.08±9.28 pg·mg-1，103.07±11.16 ng·mg-1)較NT組(15.07±5.75 pg·mg-1，32.08±7.69 ng·mg-1)明顯增高(P<0.05)；Tg/EGCG-L組和Tg/EGCG-H組小鼠海馬可溶性Aβ1-42含量分別為(35.26±6.07，33.28±10.27)pg·mg-1和不可溶性Aβ1-42含量(79.26±6.35，70.28±7.21)ng·mg-1，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

Fig 4 Effects of EGCG on autophagy related proteins in hippocampus of APP/PS1

#P<0.05vsNT;*P<0.05vsTg

Fig 5 Effects of EGCG on levels of Aβ1-42 in hippocampus of

#P<0.05vsNT;*P<0.05vsTg

3 討論

EGCG是綠茶中的一種自然多酚類化合物，研究表明[2-5]，EGCG具有很強的抗氧化、自由基清除、神經(jīng)元保護等作用，從而改善AD的認知功能。目前關于EGCG能否通過改善腦自噬、減少Aβ斑塊沉積未見報道。

研究表明[7-8]AD存在自噬功能障礙，不能降解異常蛋白質(zhì)，從而導致自噬體堆積及Aβ沉積。在mTOR信號調(diào)控下，ULK1(ubiquitin like kinase1)啟動自噬，銜接蛋白P62一側(cè)連于待降解蛋白，一側(cè)連于自噬體膜上的微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein1 light chain3，LC3)Ⅱ蛋白，然后包裹待降解蛋白和P62被選擇性清除，因此P62與自噬活性負相關，LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ代表了自噬體的堆積程度。本研究中轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠腦內(nèi)ULK1的蛋白表達下降、P62的蛋白表達增加、LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白表達增加，說明APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠存在自噬啟動受阻、識別連接待降解自噬內(nèi)容物及自噬體堆積等自噬功能障礙[7-8]。EGCG可以通過調(diào)節(jié)小鼠腦內(nèi)mTOR信號通路，上調(diào)ULK1蛋白的表達激活自噬；下調(diào)P62的蛋白表達提高識別及連接待降解自噬內(nèi)容物的能力；下調(diào)LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白表達減少腦內(nèi)自噬體堆積，有利于清除異常蛋白。

自噬是AD細胞內(nèi)清除Aβ的重要形式。AD在老年斑出現(xiàn)之前，就已經(jīng)有自噬體成熟、轉(zhuǎn)運及降解抑制、溶酶體酶增多等自噬功能障礙，從而導致了Aβ聚集[9]。本研究表明APP/PSl轉(zhuǎn)基因小鼠海馬有大量Aβ沉積，給以EGCG治療后轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)Aβ沉積減少。其機制可能是EGCG通過改善自噬功能從而增加Aβ降解。

本文證實了EGCG能促進APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦自噬啟動、提高自噬活性及減少自噬體堆積等改善自噬功能障礙，進而減少海馬Aβ沉積，從而提高了空間學習記憶能力。