張亞軍，謝福杰，胡蘇輝，張素梅，張龍現(xiàn)，王榮軍

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450046)

隱孢子蟲(Cryptosporidium)是一種寄生于細(xì)胞內(nèi)的人獸共患性原蟲，是僅次于輪狀病毒的可導(dǎo)致兒童腹瀉和死亡的第二大病原[1]，在5歲以下兒童死亡病因中，因隱孢子蟲病導(dǎo)致的死亡約占12%[2]。到目前為止，已知約有20種不同的隱孢子蟲可引起人類中度甚至重度感染，其中人隱孢子蟲和微小隱孢子蟲是主要的病原[3]。隱孢子蟲病呈世界范圍廣泛流行，主要感染胃腸道、膽道，偶爾也可感染人類和動(dòng)物的呼吸道上皮[4]。腹瀉是隱孢子蟲病的典型臨床特征；在免疫功能正常的個(gè)體中，腹瀉通常呈現(xiàn)自限性；而在嬰幼兒、免疫功能低下或障礙個(gè)體(如艾滋病患者)中，常發(fā)生持續(xù)性腹瀉，導(dǎo)致脫水、營養(yǎng)不良，甚至死亡；這些都表明機(jī)體免疫系統(tǒng)對于控制隱孢子蟲感染和清除隱孢子蟲有至關(guān)重要的作用[5-6]。體外和體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果顯示，固有免疫和獲得性免疫均參與宿主抵抗隱孢子蟲的感染過程[7-8]。因此，充分研究隱孢子蟲感染后宿主與寄生蟲的相互作用及宿主對隱孢子蟲的免疫反應(yīng)，對于預(yù)防、診斷和開發(fā)有效治療藥物具有重要意義。

細(xì)胞因子作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在宿主抗隱孢子蟲感染過程中發(fā)揮重要作用。目前,研究發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素(interleukin,IL)、干擾素(interferon,IFN)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)和轉(zhuǎn)化生長因子-β家族(transforming growth factor-β family,TGF-β family)參與感染早期抑制隱孢子蟲的入侵，感染后免疫系統(tǒng)的激活，刺激免疫細(xì)胞活化、增殖、分化和移行以及免疫細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞清除寄生蟲等一系列生物學(xué)過程[9]?，F(xiàn)綜述白細(xì)胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子、轉(zhuǎn)化生長因子等細(xì)胞因子在抵抗隱孢子蟲感染過程中的功能以及作用機(jī)制。

1 白細(xì)胞介素(interleukin，IL)

1.1 IL-4IL-4是Th2型細(xì)胞因子。在人和小鼠感染微小隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum，C.parvum)后，在感染的各個(gè)階段均可檢測到IL-4 mRNA和蛋白的表達(dá)。在小鼠和人體內(nèi)，T細(xì)胞清除C.parvum需要表達(dá)γ干擾素(IFN-γ)[10]，多個(gè)研究表明IL-4抗C.parvum的作用與IFN-γ密切相關(guān)。STUAR首次報(bào)道了Th型細(xì)胞因子IL-4在C.parvum感染小鼠的早期起限制作用；在感染前用抗IL-4中和抗體或重組IL-4處理野生型(wildtype，wt)小鼠，可分別增加或減少卵囊產(chǎn)出，表明宿主IL-4在C.parvum感染早期階段發(fā)揮保護(hù)性作用。在MCDONALD等[11]研究中，與正常小鼠相比IFN-γ缺陷小鼠排出的卵囊不受抗IL-4處理的影響，而wt小鼠中腸道IFN-γ和IL-12 mRNA的水平在感染早期比IL-4缺陷小鼠中更高，這表明IL-4直接或間接促進(jìn)IFN-γ的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的抗寄生蟲作用。而另外一項(xiàng)體外研究表明,IL-4在感染的晚期可與低濃度IFN-γ協(xié)同作用，刺激腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cells,IEC)清除C.parvum，這種現(xiàn)象能保持在感染的后期IEC對寄生蟲的有效滅活[12]。

1.2 IL-12宿主抗C.parvum感染主要與細(xì)胞介導(dǎo)的Th-1免疫應(yīng)答和2種重要細(xì)胞因子IFN-γ和IL-12的產(chǎn)生有關(guān)[13]。有研究表明，IFN-γ在針對C.parvum感染的宿主保護(hù)性免疫應(yīng)答中是必需的[14]，而IL-12是IFN-γ的誘導(dǎo)者[15]。這種細(xì)胞因子刺激NK和CD4+細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，隨后產(chǎn)生的IL-12與活化細(xì)胞的IFN-γ聯(lián)合，導(dǎo)致Th-1細(xì)胞分化并產(chǎn)生高水平的IFN-γ。IL-12在感染開始時(shí)是必不可少的，但在C.parvum持續(xù)感染時(shí)產(chǎn)生高水平的IFN-γ并不需要IL-12[16]。宿主對C.parvum感染的抗性取決于IL-12的產(chǎn)生，試驗(yàn)證明C.parvum卵囊感染前1 d用IL-12處理免疫活性或免疫缺陷的新生小鼠可防止感染的發(fā)生。C.parvum感染的嚴(yán)重程度受到內(nèi)源性IL-12的限制，因?yàn)橛肐L-12抗體處理會(huì)加劇C.parvum的感染。此外，在感染1 d后用外源IL-12處理C.parvum感染的小鼠，盡管不能阻止C.parvum感染，但檢測到C.parvum感染強(qiáng)度減弱。事實(shí)上，IL-12限制C.parvum感染的能力可能是由于殺死裂殖子所致。外源性IL-12不能清除已經(jīng)建立的C.parvum感染，表明該細(xì)胞因子的使用是預(yù)防性的[17]。由于C.parvum寄生部位局限在胃腸道上皮，可以通過在腸黏膜上外源性加入IL-12來預(yù)防C.parvum的感染，而不引起全身性毒性。另外，由于IL-12產(chǎn)生缺陷導(dǎo)致內(nèi)源性IL-12無法表達(dá)的C.parvum易感患者也可通過使用外源性IL-12控制C.parvum感染。

1.3 IL-17有研究顯示，IL-17及其家族成員在抗多種原生動(dòng)物感染過程中發(fā)揮重要作用[18]。C.parvum感染過程中，通過引起絨毛中的腸細(xì)胞損失致使絨毛萎縮，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞收縮來維持連續(xù)的上皮屏障。隨著腸細(xì)胞的丟失，腸絨毛逐漸變短，最終引起腹瀉[19]。腸上皮細(xì)胞丟失是C.parvum導(dǎo)致腹瀉的重要原因，有研究證實(shí)，IL-17可減輕C.parvum對宿主上皮細(xì)胞的損傷。DRINKALL等[20]在牛腸道模型中研究發(fā)現(xiàn)，IL-17在C.parvum感染后迅速上升，同時(shí)能減輕由C.parvum導(dǎo)致的宿主細(xì)胞損傷。

1.4 IL-18IL-18是由腸上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞表達(dá)的促炎細(xì)胞因子[21]。體內(nèi)外研究表明，IL-18在限制C.parvum感染中起關(guān)鍵作用[22]。BEDI等[23]使用SCID小鼠研究發(fā)現(xiàn),減少IL-18的表達(dá)可顯著增加C.parvum感染強(qiáng)度，而用重組IL-18處理可顯著降低寄生蟲感染強(qiáng)度。另一研究顯示，用抗IL-18抗體處理后的小鼠其腸道IFN-γ水平降低，C.parvum感染強(qiáng)度增加，表明IL-18對于IFN-γ的表達(dá)是必需的。MCDONALD等[24]研究表明，IL-18也可通過刺激IEC增加抗菌活性來介導(dǎo)其保護(hù)作用。BEDI等[23]研究顯示，用重組IL-18處理的小鼠其小腸組織中抗微生物肽和β防御素3的mRNA表達(dá)顯著增加。IL-18可通過不同途徑介導(dǎo)其C.parvum作用，如通過IFN-γ誘導(dǎo)或直接刺激腸上皮細(xì)胞，以增加抗菌活性，進(jìn)而抵抗C.parvum感染。

2 干擾素(interferon，IFN)

IFN分為Ⅰ型IFN和Ⅱ型IFN，Ⅰ型IFN包括α和β，Ⅱ型IFN包括γ。

2.1 Ⅰ型IFNⅠ型IFN在C.parvum感染早期由感染的腸細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生，并且參與抗C.parvum感染的保護(hù)性先天性免疫反應(yīng)，直接抑制C.parvum的發(fā)育，并且Ⅰ型IFN不依賴于IFN-γ[25]。目前，IFN-α/β如何在感染的腸細(xì)胞中被誘導(dǎo)、表達(dá)尚不清楚，但可能涉及Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)。Ⅰ型IFN表達(dá)可以通過大多數(shù)TLR(如TLR4)的信號傳導(dǎo)而被激活，并且顯示該病原體的識別受體在寄生蟲附著或侵入腸細(xì)胞表面上累積并參與啟動(dòng)受感染細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。據(jù)報(bào)道，TLRs對C.parvum具有免疫作用：給新生的小鼠口服未甲基化的CpG寡核苷酸(TLR9的配體)刺激了對感染的強(qiáng)烈抵抗[26]，髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88,TLR信號傳導(dǎo)中的銜接蛋白)缺失小鼠比野生型小鼠更容易受到感染[27]。IFN-α/β對C.parvum的清除作用，可能涉及NK細(xì)胞對已感染細(xì)胞的溶解作用[28]。

2.2 Ⅱ型IFN有研究表明，IFN-γ能直接誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞對C.parvum感染的抵抗力，抑制C.parvum在細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育。POLLOK等[29]利用HT-29、Caco-2、H4等3種細(xì)胞系研究IFN-γ對C.parvum感染的影響，發(fā)現(xiàn)在感染前24～72 h或接種后2 h，在HT-29和Caco-2細(xì)胞系中加入IFN-γ，可顯著抑制C.parvum感染，其中在HT-29細(xì)胞中的抑制效果最強(qiáng)，在Caco-2細(xì)胞中觀察到的抑制效果較弱，但在H4細(xì)中IFN-γ對C.parvum感染沒有抑制作用。通過進(jìn)一步對細(xì)胞中IFN-γ受體表達(dá)情況進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，3種細(xì)胞系中IFN-γ受體表達(dá)量不同是造成這種抑制效果差異的原因。在3種細(xì)胞系中，IFN-γ受體在HT-69細(xì)胞中表達(dá)最高，Caco-2細(xì)胞中表達(dá)次之，而在H4細(xì)胞中則沒有檢測到IFN-γ受體的表達(dá)。IFN-γ不能抑制H4細(xì)胞中C.parvum的感染，排除了IFN-γ對寄生蟲的直接抑制作用，間接證明了IFN-γ受體的表達(dá)在IFN-γ介導(dǎo)的抑制寄生蟲感染中起關(guān)鍵作用，并且可以解釋為什么IFN-γ介導(dǎo)的寄生蟲抑制在HT-29細(xì)胞中更有效。IFN-γ通過結(jié)合IFN-γR，導(dǎo)致JAK2激活STAT1a，在細(xì)胞水平抑制寄生蟲感染。通過加入JAK2特異性抑制劑tyrphostin B42減輕IFN-γ對寄生蟲感染的抑制，進(jìn)一步證明了IFN-γR可在腸上皮細(xì)胞抑制C.parvum感染。該研究還發(fā)現(xiàn)IFN-γ的抑制作用發(fā)生在C.parvum入侵和細(xì)胞內(nèi)發(fā)育這2個(gè)階段，但I(xiàn)FN-γ的抑制作用在C.parvum發(fā)育階段強(qiáng)于入侵階段。這可能與細(xì)胞內(nèi)的Fe2+濃度有關(guān)；IFN-γ介導(dǎo)的寄生蟲感染抑制作用隨著外源性FeSO4劑量的降低而升高。此外，有研究表明腸黏膜中IFN-γ的產(chǎn)生也與寄生蟲感染后的宿主恢復(fù)有關(guān)[30]。

3 腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)

TNF-α是可由上皮細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的一種炎性細(xì)胞因子，通常在炎癥中起關(guān)鍵作用，并且可以參與針對細(xì)胞內(nèi)感染的免疫保護(hù)機(jī)制[31]。在感染C.parvum的人的腸中觀察到TNF-α水平升高。另外，C.parvum感染異種移植到SCID小鼠中的腸道觀察到TNF-α的表達(dá)[32]。體外研究表明，TNF-α可以抑制人腸上皮細(xì)胞系HT-29細(xì)胞的C.parvum感染。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，受C.parvum感染的IFN-γ缺陷BALB/c小鼠，其脾細(xì)胞的TNF-α表達(dá)在感染期間增加[33]；使用TNF-α處理IFN-γ缺陷B.6小鼠可減輕感染[34]；這表明TNF-α可能參與控制C.parvum感染的免疫機(jī)制。另外一項(xiàng)研究表明，TNF-α可通過阻止C.parvum侵襲宿主細(xì)胞來抑制C.parvum在腸上皮細(xì)胞的繁殖[35]，但缺乏TNF-α不會(huì)增加宿主對C.parvum的易感性；IFN-γ相關(guān)的免疫機(jī)制并不需要TNF-α的存在，在不涉及TNF-α的情況下仍可實(shí)現(xiàn)對宿主中C.parvum感染的清除[36]。

研究表明，TNF-α還可能與C.parvum感染導(dǎo)致的腹瀉相關(guān)。KANDIL等[37]認(rèn)為TNF-α是豬C.parvum病腹瀉的主要因素。THIBAUT等[35]的研究也支持這種觀點(diǎn)，并指出新生小鼠在感染C.parvum期間，聚集的大量炎性單核細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α可能破壞了上皮細(xì)胞間的緊密連接，導(dǎo)致腸道通透性增加。因此，在免疫正常的個(gè)體中通過抑制TNF-α減輕腸道癥狀，可能會(huì)成為一種減輕腹瀉癥狀的免疫療法。此外，ROBINSON等[38]對患有C.parvum病志愿者的空腸進(jìn)行檢測表明，TNF-α在人體內(nèi)的表達(dá)與C.parvum的感染相關(guān)，而與腸道癥狀無關(guān)。這可能與不同年齡階段的宿主免疫反應(yīng)不同有關(guān)。

4 轉(zhuǎn)化生長因子-β家族(transforming growth factor-β family，TGF-β family)

TGF-β是一種重要的宿主免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑，在感染C.parvum并且有癥狀的志愿者的空腸黏膜中觀察到TGF-β1的表達(dá)增加[39]。當(dāng)用C.parvum感染人結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2時(shí)，Caco-2腸細(xì)胞本身可以在體外分泌TGF-β[40]，表明這種細(xì)胞因子的潛在重要來源是腸細(xì)胞。TGF-β不能影響寄生蟲活性，但能抑制由C.parvum感染誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞的損傷。外源性TGF-β通過誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞中的蛋白激酶C途徑，可顯著降低細(xì)胞的通透性并減少由C.parvum引起的細(xì)胞壞死，在體外具有保護(hù)上皮細(xì)胞單層的屏障功能[41]。LEAN等[36]研究表明，TGF-β通過抑制IFN-γ從而抑制腸上皮細(xì)胞對C.parvum發(fā)育的抑制作用，這是因?yàn)門GF-β具有抗炎作用。

5 結(jié)語

宿主腸上皮細(xì)胞以及免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，在抗C.parvum入侵以及清除蟲體的過程中具有重要作用。然而，細(xì)胞因子與腸上皮細(xì)胞、機(jī)體免疫系統(tǒng)之間的相互作用機(jī)制尚不清楚。已有研究表明，一些細(xì)胞因子如IFN-γ和IL-12是宿主抗C.parvum感染的必需因子；IL-4和IL-18等是非必需因子，但能增強(qiáng)上皮細(xì)胞的抗感染能力；IL-17和TGF-β等細(xì)胞因子能夠減輕C.parvum導(dǎo)致的腹瀉癥狀。目前，尚未有用于治療C.parvum病的特效藥物，因此研究細(xì)胞因子在宿主抗C.parvum感染過程中的作用機(jī)制對于開發(fā)免疫療法具有重要意義。