程雅婷，鮮凌瑾，武秋申，揭曉蝶，田 旭，陳霈瑤，李開秀，鐘 航，章 杰*

(1.西南大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，重慶 402460；2.樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 樂山 614000；3.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460)

飼糧纖維是指植物中固有的、完整的不易被動物小腸消化酶所消化利用，但能被大腸微生物發(fā)酵利用的可食碳水化合物和木質(zhì)素的總稱[1]。研究表明，在飼糧中適量添加纖維有利于動物的生長發(fā)育。GONZLEZ-ALVARADO等[2]研究顯示飼糧中添加燕麥殼和大豆殼可顯著提高肉仔雞日增體質(zhì)量、平均日采食量、料重比以及有機物、可溶性灰分和脂肪等的消化率。MARGüENDA等[3]研究指出,飼糧中添加37%中性洗滌纖維水平可提高兔日采食量和胴體產(chǎn)量，降低生長期死亡率。RENAUDEAU等[4]報道在母豬哺乳期飼喂高纖維飼糧(20%中性洗滌纖維)可增加仔豬的生長速度和體質(zhì)量。此外，研究還發(fā)現(xiàn)飼糧中添加不同來源的纖維對動物生長發(fā)育具有不同的影響。HE等[5]研究了飼糧中添加玉米秸稈、蒸汽爆破玉米秸稈、蒸汽爆破麥秸和蒸汽爆破稻草對灰鵝生長發(fā)育的影響，結(jié)果顯示飼喂玉米秸稈的平均日采食量和飼料轉(zhuǎn)化率最高。JIMéNEZ-MORENO等[6]研究了纖維素、甜菜漿、燕麥殼飼糧對肉雞胃腸道發(fā)育和pH值的影響，結(jié)果指出甜菜漿和燕麥殼可降低胃腸道的pH值，提高脂肪、灰分和淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)的消化率。反芻動物對飼糧纖維的消化利用主要依靠瘤胃微生物，單胃動物則主要依靠腸道后段內(nèi)的微生物，而胃腸道微生物是影響宿主營養(yǎng)吸收、能量代謝、免疫平衡和生長繁殖的重要因素之一[7]。因此，研究腸道微生物菌群構(gòu)成是了解飼糧纖維對宿主生長發(fā)育影響的基礎(chǔ)。CHEN等[8]研究表明,飼糧中添加豌豆和麥麩可增加腸道有益微生物的濃度來抵抗細(xì)胞外病原體數(shù)量，進而降低斷奶仔豬的發(fā)病率。AMERAH等[9]研究指出,不同纖維源會影響回腸微生物菌群特征，從而改變營養(yǎng)物質(zhì)的消化率。鵝是草食性家禽，具有耐粗飼的特點，可大量利用草和秸稈，對粗纖維的消化率可達(dá)40%～50%，是研究動物飼糧纖維理論基礎(chǔ)的理想模型[10]。目前，鵝因耗精料少而在中國被大范圍養(yǎng)殖，飼養(yǎng)量占全球總量的90%以上[11]，但不同來源的纖維飼糧對鵝腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響鮮見報道。因此，本試驗以四川白鵝為研究對象，探討了不同纖維源(苜蓿、黑麥、燕麥和花生秧)飼糧對其腸道微生物菌群的影響，為更好地了解四川白鵝對粗纖維的消化利用情況提供科學(xué)數(shù)據(jù)，同時也為生產(chǎn)實際中利用牧草纖維及制定飼糧配方提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物選取體況健康、體質(zhì)量相近的1日齡四川白鵝120只，隨機分為4組，分別為苜蓿組、黑麥組、燕麥組和花生秧組，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)10只鵝。試驗在西南大學(xué)畜牧實訓(xùn)基地進行，采用半開放式鵝舍，地面圈養(yǎng)，自由采食與飲水，每日飼喂4次(7：30，12：30，17：00，21：00)。試驗持續(xù)時間為70 d，試驗飼糧組成及營養(yǎng)成分見表1。試驗期環(huán)境溫度為(28.77±0.11)℃，濕度為(86.78±0.42)%。

1.2 生長性能測定70日齡時進行空腹稱體質(zhì)量(稱體質(zhì)量前禁食6 h)，記錄并計算平均日增體質(zhì)量(ADG:average daily gain)、平均日采食量(ADFI:average daily feed intake)和料重比(F/G)。

1.3 腸道微生物采集70日齡時，每組隨機選取3只鵝進行屠宰，迅速取出盲腸并結(jié)扎，經(jīng)75%酒精擦拭消毒外表后轉(zhuǎn)移至無菌超凈臺。將盲腸剪開后用無菌生理鹽水沖洗腸道內(nèi)壁，沖洗干凈后，用滅菌手術(shù)刀片輕輕刮取腸道黏膜并收集于凍存管中，于-80℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ)) %

1.4 16S rRNA PCR擴增及測序利用QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qiagen，德國)提取微生物總DNA，然后選用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACH VGGGTWTCT AAT-3′)對16S rRNA(V3-V4)區(qū)進行PCR擴增，其中引物338F的5′尾端帶有條形碼標(biāo)記。PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸90 s，22個循環(huán)；最后72℃延伸8 min。將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進行定量檢測，之后按照每個樣本的測序量要求進行相應(yīng)比例的混合來構(gòu)建Miseq文庫并進行Miseq測序。

1.5 測序序列處理測序得到雙端序列數(shù)據(jù)，根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對的reads 拼接(merge)成1條序列，允許的最大錯配比率為0.2，最小overlap長度為10 bp，篩選掉不合格序列。根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分有效序列，并調(diào)整序列方向，barcode允許的錯配數(shù)為0，最大引物錯配數(shù)為2。同時對reads的質(zhì)量和merge的效果進行質(zhì)控，過濾reads尾部質(zhì)量值20以下的堿基，設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于 20，從窗口開始截去后端堿基,并且過濾質(zhì)控后50 bp以下的reads，去除含N堿基的reads。

1.6 生物信息學(xué)分析在97%相似度下通過Usearch(version7.1)軟件將序列進行聚類，得到分類操作單元(OTUs)。通過RDP Classifer將OTUs代表序列與數(shù)據(jù)庫Silva進行比對，置信度閾值為0.6[12]，進而分析物種多樣性指數(shù)及群落結(jié)構(gòu)。同時利用序列數(shù)量與其所代表的OTU數(shù)目來構(gòu)建稀釋曲線，以及利用序列數(shù)量在不同測序深度時的微生物多樣性指數(shù)來構(gòu)建Shannon-winner曲線。

1.7 多樣性分析根據(jù)樣本OTU數(shù)據(jù)來估計菌群的α多樣性和β多樣性。α多樣性以物種豐富度指數(shù)(Chao和Ace)和多樣性指數(shù)(Shannon和Simpson)表現(xiàn)。利用β多樣性距離矩陣，使用非加權(quán)組平均算法構(gòu)建樹狀結(jié)構(gòu)，然后使用主成分分析(PCA)和主坐標(biāo)分析(PCoA)進行可視化展示。

1.8 數(shù)據(jù)處理采用SAS 8.2軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用F檢驗對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著，并用Met-astats方法對各處理組間物種差異性進行分析。

2 結(jié)果

2.1 生長性能分析由表2可知，不同纖維源飼糧組鵝初始體質(zhì)量(1日齡)差異不顯著(P>0.05)，符合隨機取樣的原則，排除個體差異對結(jié)果的影響，表明本研究結(jié)果具有代表性。結(jié)束體質(zhì)量(70日齡)和平均日增體質(zhì)量在不同纖維源飼糧組之間差異顯著(P<0.05)，其中苜蓿組顯著高于黑麥組(P<0.05)，與燕麥組和花生秧組無顯著性差異(P>0.05)，而黑麥組、燕麥組和花生秧組之間差異均不顯著(P>0.05)；并且兩者變化趨勢一致，均為苜蓿組>花生秧組>燕麥組>黑麥組。不同纖維源飼糧組平均日采食量和料重比差異不顯著(P>0.05)，變化趨勢均為燕麥組>黑麥組>花生秧組>苜蓿組。上述結(jié)果表明，鵝對不同纖維源飼糧在消化利用率上存在差異，暗示對腸道具有調(diào)控作用的微生物菌群的差異。

表2 不同纖維源飼糧組鵝生產(chǎn)性能比較

2.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估由表3可知，本次12個測序序列文庫覆蓋率均達(dá)到了99.7%以上，共得到803 498條有效序列，335.7 Mp堿基，平均序列長度為438.14 bp，比對得到877個OTUs(苜蓿組：583；黑麥組：478；燕麥組：470；花生秧組：443)。此外，稀釋曲線及Shannon-winner曲線均隨著測序數(shù)據(jù)量的增加趨于平坦(圖1)，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，數(shù)據(jù)具有代表性和真實性，可以反映樣本中微生物菌群信息。

表3 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

圖1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估 A.稀釋曲線；B.Shannon-winner曲線

2.3 腸道微生物菌群α多樣性分析如表4所示，Chao、Ace、Shannon和Simpson在不同纖維源飼糧組之間差異均不顯著(P>0.05)，其中Chao和Ace指數(shù)為苜蓿組>花生秧組>黑麥組>燕麥組，說明苜蓿組微生物菌群豐富度較高，而燕麥組微生物菌群豐富度最低。Simpson和Shannon指數(shù)在不同纖維源飼糧組之間變化趨勢不一致，但研究表明多樣性指數(shù)區(qū)分度越大，其有效性越高[13]。本試驗數(shù)據(jù)顯示Shannon指數(shù)區(qū)分度高于Simpson指數(shù)，故本研究采用Shannon指數(shù)評估微生物菌群多樣性。不同纖維源飼糧組之間Shannon指數(shù)為花生秧組>苜蓿組>黑麥組>燕麥組，說明花生秧組微生物菌群多樣性較高，而燕麥組最低。

表4 腸道微生物多樣性指數(shù)

2.4 腸道微生物菌群組成分析

2.4.1門水平上微生物菌群組成分析 如圖2A所示，不同纖維源飼糧組在門水平上共得到15種已知細(xì)菌(苜蓿組14種，花生秧組12種，黑麥組15種，燕麥組14種)，其中12種為共有細(xì)菌，說明這12種細(xì)菌在維持腸道菌群功能上發(fā)揮著重要的作用，不會輕易受飼糧的變化而發(fā)生改變。比較細(xì)菌相對豐度可知(圖2B)，不同纖維源飼糧組相對豐度大于0.1% 的優(yōu)勢細(xì)菌均為11種共有細(xì)菌，其中厚壁菌門(Firmicutes)占到了65.91%～68.05%，擬桿菌門(Bacteroidetes)占到了16.84%～18.17%，變形桿菌門(Proteobacteria)占到了4.58%～5.70%，放線菌門(Actinobacteria)占到了4.45%～4.78%。

圖2 門水平菌群組成分析 A.韋恩圖；B.門水平上菌群相對豐度分布

2.4.2屬水平上微生物菌群組成分析 由圖3A可知，不同纖維源飼糧組在屬水平上共得到155個已知細(xì)菌(苜蓿組138種，花生秧組126種，黑麥組127種，燕麥組124種)，其中108種為共有細(xì)菌，說明這108種細(xì)菌在維持腸道菌群功能上發(fā)揮著重要的作用，不會輕易受飼糧的變化而發(fā)生改變。此外，有26種細(xì)菌為不同纖維源飼糧組所特有(苜蓿組11種、黑麥組5種、燕麥組2種、花生秧組8種)，說明這些細(xì)菌可能與不同纖維源飼糧有直接聯(lián)系。比較細(xì)菌相對豐度可知(圖3B)，苜蓿組相對豐度含量大于0.1%的優(yōu)勢菌屬有66種，占總豐度的97.64%；黑麥組有67種，占98.20%；燕麥組有63種，占98.11%；花生秧組65種，占97.89%；說明腸道微生物菌群功能的實現(xiàn)主要依靠優(yōu)勢細(xì)菌。從單一菌屬來看，某些菌屬所占比例很高，并且不同纖維源飼糧組之間有所差異，比如苜蓿組Bacteroides(18.76%)、Megamonas(14.88%)、[Ruminococcus]_torques_group(6.67%)；黑麥組Bacteroides(18.70%)、Megamonas(10.63%)、[Ruminococcus]_torques_group(6.69%)；燕麥組Bacteroides(17.06%)、Megamonas(11.67%)、[Ruminococcus]_torques_group(6.1%)；花生秧組Bacteroides(24.37%)、[Ruminococcus]_torques_group(6.3%)、Desulfovibrio(6.1%)。

圖3 屬水平上菌群組成分析 A.韋恩圖；B.屬水平上菌群相對豐度分布

2.5 腸道微生物菌群β多樣性分析如圖4所示，PCA和PCoA分析結(jié)果均顯示不同纖維源飼糧組在第一軸明顯發(fā)生了分離(PC1+PC2>50%)，且同一纖維源飼糧組的重復(fù)之間較為接近，表明飼糧中的纖維來源對鵝腸道微生物菌群有一定的影響。

圖4 PCA和PCoA分析

2.6 腸道微生物菌群豐度差異性分析對不同纖維源飼糧組之間共有的優(yōu)勢菌群相對豐度分析顯示(表5)，門水平上僅有黏膠球菌(Lentisphaerae)差異顯著(P<0.05)，其中燕麥組和苜蓿組顯著高于花生秧和黑麥組(P<0.05)，而花生秧和黑麥組之間差異不顯著(P>0.05)。屬水平上有理研菌(Alistipes)、梭菌(Shuttleworthia)、互養(yǎng)菌(Synergistes)、放線菌(Slackia)、真桿菌(Eubacteriumcoprostanoligenes)、多形桿狀菌(Bacteroides)、瘤胃菌(Faecalibacterium)、巨單胞菌(Megamonas)和柔嫩梭菌(Subdoligranulum)差異顯著(P<0.05)，其中花生秧組Alistipes顯著高于燕麥組、黑麥組和苜蓿組(P<0.05)，且苜蓿組和黑麥組顯著高于燕麥組，但兩者之間差異不顯著(P>0.05)；燕麥組Shuttleworthia顯著低于苜蓿組、黑麥組及花生秧組(P<0.05)，且苜蓿組、黑麥組及花生秧組之間差異不顯著(P>0.05)；Slackia在苜蓿組和花生秧組之間差異不顯著(P>0.05)，但均顯著低于燕麥草組(P<0.05)；Bacteroides在苜蓿組、黑麥組和燕麥組之間差異不顯著(P>0.05)，且顯著低于花生秧組(P<0.05)；黑麥組Faecalibacterium顯著低于苜蓿組、燕麥組和花生秧組(P<0.05)，且苜蓿組顯著高于花生秧組(P<0.05)，但與燕麥組差異不顯著(P>0.05)；苜蓿組Megamonas顯著高于黑麥組、燕麥組和花生秧組(P<0.05)，黑麥組和燕麥組顯著高于花生秧組(P<0.05)；Subdoligranulum在燕麥組和花生秧組之間差異不顯著(P>0.05)，但顯著低于苜蓿組和黑麥組(P<0.05)，且苜蓿組顯著高于黑麥組(P<0.05)；Eubacteriumcoprostanoligenes在花生秧組和黑麥組之間差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于燕麥組(P<0.05)。

表5 腸道微生物菌群豐度差異 %

3 討論

飼糧是畜禽動物賴以生存的基礎(chǔ)，通過腸道消化酶攝取其營養(yǎng)成分如蛋白質(zhì)、糖類、水分和脂肪等，然后合成機體所需的物質(zhì)并釋放能量來維持生命活動，而將不被消化酶分解的成分(纖維素、木質(zhì)素等)運送至腸道后段，依靠腸道微生物作用進行消化吸收，為機體提供所需的代謝底物、酶和能量[14]。腸道微生物主要包括保護機體免受傷害及提高機體免疫力的共生微生物和使機體感染或誘發(fā)疾病的有害微生物[15]，均依附于機體提供的營養(yǎng)物質(zhì)來生長繁殖，受到飼糧組成成分影響。因此，飼糧纖維源的不同將引起腸道微生物菌群組成的變化[16]。

目前，飼糧纖維的來源主要是干草、秸稈和農(nóng)副產(chǎn)品等，其選擇依據(jù)是種植廣泛、營養(yǎng)豐富、產(chǎn)量高和適口性好，備受畜禽動物的喜愛[17-20]。因此，本試驗選用苜蓿、黑麥、燕麥和花生秧作為纖維源來探討其對鵝腸道微生物菌群的影響，在此采用了高通量測序法從分子水平來檢測微生物菌群種類及數(shù)量，并進行了OTU分類、多樣性指數(shù)及群落結(jié)構(gòu)等統(tǒng)計分析。與前人[21]研究結(jié)果相比，該研究的微生物菌群多樣性明顯提高，優(yōu)勢菌門屬種類及相對豐度有所差異，這可能是由于高通量測序法與傳統(tǒng)的培養(yǎng)法相比有明顯的優(yōu)勢，前者對細(xì)菌的覆蓋率和準(zhǔn)確性更高，錯誤率較低[22]。此外，所選鵝品種、腸道黏膜發(fā)育狀態(tài)、纖維源類型也可能是造成差異的原因。

本試驗結(jié)果表明，飼喂苜蓿、燕麥、黑麥和花生秧等4種纖維源飼糧對鵝腸道微生物菌群多樣性無顯著性影響(P>0.05)，表明它們之間的腸道微生物菌群組成基本一致，而腸道微生物菌群組成主要受遺傳和環(huán)境因素的影響[23]，因此，推測不同纖維源對腸道菌群無顯著性影響的原因：一是該研究對象為四川白鵝這一品種，其遺傳背景一致；二是飼養(yǎng)的外部環(huán)境條件完全一樣，如溫度、濕度、光照等；三是不同飼糧纖維組成相同，均包含中性、酸性和堿性洗滌纖維，區(qū)別在于各組分所占比例不同。雖然纖維源對微生物菌群多樣性的影響從統(tǒng)計學(xué)上來看不顯著，但相互之間也存在高低差異，比如花生秧組多樣性高于其他組，這主要與花生秧的粗纖維含量高有關(guān)，即粗纖維含量越高，相應(yīng)的降解酶種類需要量越多，其微生物多樣性越高[24]。腸道微生物菌群的豐度分析顯示各纖維源組的優(yōu)勢菌門主要是Firmicutes和Bacteroidetes，兩者占到總豐度的80%以上，此與前人對反芻動物瘤胃及家禽腸道微生物菌群的研究結(jié)果基本一致[25-26]，但各菌門比例略有不同，這主要與動物種類有關(guān)。

DE FILIPPO等[27]研究發(fā)現(xiàn)，Bacteroidetes對纖維具有極強的消化能力。DALY等[28]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)irmicutes和Bacteroidetes包含有許多纖維分解菌。上述結(jié)論以此佐證了本研究中優(yōu)勢菌屬(Bacteroides、Ruminococcus、Megamonas)均為桿菌門下菌屬的合理性。此外，苜蓿和燕麥組的纖維素分解菌門的數(shù)量有所升高，這與PITTA等[29]研究指出的纖維素分解菌門(屬)數(shù)量與纖維素含量呈正相關(guān)的結(jié)論一致。

對微生物菌群相對豐度進行差異性分析發(fā)現(xiàn)不同的纖維源在門水平上顯著影響Lentisphaerae，研究證實Lentisphaerae的豐度與纖維二糖的降解有關(guān)[30]。本試驗中燕麥組和苜蓿組Lentisphaerae豐度高于黑麥組和花生秧組，可能歸因于前者可溶性纖維含量較高，需要更多的Lentisphaerae來進行降解。在屬水平上豐度受到顯著影響的有Alistipes、Shuttleworthia、Slackia、Eubacteriumcoprostanoligenes、Bacteroides、Faecalibacterium、Megamonas和Subdoligranulum。Bacteroides可通過編碼多種糖苷酶來水解并利用宿主攝入的植物性多糖[31]，進而促進碳水化合物的代謝，其豐度與飼糧多糖含量有關(guān)[32]。本試驗中花生秧組Bacteroides顯著高于苜蓿、黑麥和燕麥組，可能是花生秧粗纖維含量較高且植物性細(xì)胞壁含量多。Subdoligranulum、Faecalibacterium和Megamonas均屬于厚壁菌門，Subdoligranulum和Faecalibacterium可表達(dá)乙酰/丙酰輔酶A羧化酶，參與丁酸鹽的合成，而Megamonas則主要參與丙酸鹽的合成[33]。丁酸鹽和丙酸鹽等短鏈脂肪酸的合成與細(xì)菌的發(fā)酵作用有關(guān)，飼糧中可溶性多糖越多，需要的細(xì)菌的數(shù)量越多。Eubacteriumcoprostanoligenes是可降低膽固醇的微生物[34]，其在不同纖維源飼糧組的差異性可能與飼糧所含脂質(zhì)的量有關(guān)。Alistipes和Shuttleworthia是致病菌屬，TYRRELL等[35]研究指出Alistipes是革蘭陰性厭氧桿菌，具有膽汁抗性，主要存在于病畜腸道和腹部。Slackia主要與人類牙周炎有關(guān)[36]，但在腸道中的作用尚不清楚。MCDONALD等[37]研究表明珍珠大麥中的纖維會增加仔豬腸道病原菌，提高腹瀉率。因此，以上與致病、感染等有關(guān)的菌屬豐度在不同纖維源飼糧間具有顯著性差異，可能是纖維源中的抗?fàn)I養(yǎng)因子(黃酮、單寧、蛋白酶抑制因子和植酸等)的差異所引起的[38]。

本試驗通過對四川白鵝飼喂苜蓿、黑麥、燕麥和花生秧4種纖維源飼糧研究纖維源對腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，不同纖維源飼糧對腸道微生物菌群多樣性無顯著性差異(P>0.05)，但可影響菌群結(jié)構(gòu)及顯著影響Lentisphaerae、Alistipes、Shuttleworthia、Slackia、Eubacteriumcoprostanoligenes、Bacteroides、Faecalibacterium、Megamonas和Subdoligranulum的相對豐度(P<0.05)。