王 鑫，楊在賓，周建群，李丹丹，李鵬飛，劉凱紅，張銀鳳，楊維仁，姜淑貞*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院 山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室，山東 泰安 271018；2.南寧市澤威爾飼料有限責(zé)任公司，廣西 南寧 530221)

微量元素是動物生長發(fā)育的重要營養(yǎng)物質(zhì)，也是動物體內(nèi)多種酶的重要組成部分，對動物機體代謝和健康發(fā)育起著十分重要的作用[1-2]。與傳統(tǒng)的無機微量元素相比，有機微量元素具有生物學(xué)利用率高和減少環(huán)境污染等優(yōu)勢[3-7]。研究表明，銅-殼聚糖納米顆粒(100 mg/kg)可以提高肉仔雞的生長性能[8]，羥基蛋氨酸螯合鋅(60 mg/kg)能夠提高1～6周齡肉仔雞的生長性能[9]。通過甘蔗糖蜜與硫酸銅、鋅、錳、鐵螯合制備的寡二糖螯合微量元素，能夠滿足肉雞對多種微量元素的需要，可以取代無機微量元素，其純度高，穩(wěn)定性好，安全無污染[10]。然而，寡二糖螯合微量元素對肉雞生長性能、血液和肝臟中微量元素含量和抗氧化的影響卻鮮有報道，本試驗旨在探究梯度降低寡二糖螯合微量元素水平對肉雞生長性能、血液和肝臟中微量元素含量和抗氧化的影響，為肉雞飼糧中減少微量元素的使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 微量元素預(yù)混劑

1.1.11‰無機微量元素(inorganic trace elements，IE)預(yù)混劑 銅(CuSO4·5H2O，飼料級，98.5%)、鋅(ZnSO4·H2O，98.5%)、錳(MnSO4·H2O，99.0%)、鐵(FeSO4·H2O，98.5%)、碘(KIO3，99.0%)、硒(Na2SeO3，98.5%)含量分別為8.0，70.0，90.0，50.0，0.5，0.3 mg/kg，稀釋劑選擇沸石粉，泰安市泰航礦物飼料預(yù)混劑有限公司生產(chǎn)。

1.1.2寡二糖螯合微量元素(oligosaccharides chelated trace elements，OE)預(yù)混劑 由寡二糖螯合微量元素(銅、鋅、錳和鐵)、KIO3(飼料級，99.0%)和Na2SeO3(飼料級，98.5%)組成，其銅、鋅、錳、鐵、碘和硒含量同1‰的無機微量元素預(yù)混劑，由南寧市澤威爾飼料有限責(zé)任公司提供。

1.2 試驗動物、飼糧和試驗設(shè)計選擇600只健康的1日齡AA商品肉仔雞，隨機分成6個處理，每個處理5個重復(fù)，每個重復(fù)20只，各處理間初始體質(zhì)量差異不顯著(P>0.05)。處理1為無機微量元素(IE-100)處理，添加自制1‰無機微量元素預(yù)混劑，使飼糧中銅、鋅、錳、鐵、碘和硒的添加量分別為8.0,70.0,90.0,50.0,0.5,0.3 mg/kg;處理2、處理3、處理4和處理5為有機復(fù)合微量元素處理，添加寡二糖螯合微量元素預(yù)混劑(寡二糖螯合銅、鋅、錳和鐵；KIO3和Na2SeO3)，使飼糧中元素水平分別為處理1的100%(OE-100)、75%(OE-75)、50%(OE-50)和25%(OE-25)；處理6為不添加微量元素(OE-0)。試驗分(1～21 d和22～42 d)2個階段，其基礎(chǔ)飼糧和營養(yǎng)水平參考NRC(2012)推薦標(biāo)準(zhǔn)配制(表1)。飼糧微量元素水平實測值見表2。

表1 基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)水平 %

表2 日糧微量元素實測值 mg/kg

1.3 飼養(yǎng)管理肉雞在同一雞舍內(nèi)進行籠內(nèi)飼養(yǎng)，進雞前24 h對雞舍進行全面打掃和消毒，并將室溫升至35～36℃。試驗過程中，保證肉雞連續(xù)光照、自然通風(fēng)、自由采食和飲水，每天清掃雞舍，常規(guī)進行免疫。

1.4 測定指標(biāo)和方法

1.4.1生產(chǎn)性能 試驗期間每天記錄采食量，并于試驗1，21，42 d時以重復(fù)為單位測體質(zhì)量。計算日均采食量(ADFI)、平均日增體質(zhì)量(ADG)和料重比(F/G)。

1.4.2血樣的采集與處理 于試驗21，42 d每個重復(fù)隨機選擇2只雞禁食12 h，使用真空抗凝管翅根靜脈無菌采血10 mL，再用真空促凝管無菌采血10 mL?？鼓湃?20℃冰箱中保存，用于檢測血液中微量元素銅、錳、鋅、鐵的存儲量；促凝血傾斜放置溫水中30 min，2 000 r/min離心10 min分離血清，血清分裝編號后-20℃保存，用于檢測血清抗氧化物酶和丙二醛含量。

1.4.3屠宰試驗和肝臟樣品的采集 于試驗21，42 d 每個重復(fù)隨機選擇2只雞禁食24 h后，放血屠宰，打開腹腔迅速取約100 g肝臟組織置于自封袋-20℃保存，用于檢測肝臟中微量元素銅、錳、鋅、鐵的存儲量；同時再取約10 g肝臟組織置于凍存管-20℃ 保存，用于檢測肝臟抗氧化物酶活性和丙二醛含量。

1.4.4微量元素存儲量的測定 采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(GB2009.268-2016)測定血液和肝臟中微量元素銅、錳、鋅存儲量，采用火焰原子吸收光譜法(GB2009.90-2016)測定微量元素鐵的存儲量。

1.4.5血清抗氧化物酶和丙二醛含量的測定 Cu-Zn超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)根據(jù)黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)測定，根據(jù)化學(xué)比色法測定谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)的含量。Cu-Zn SOD(A001-1)、GSH-Px(A005)和 MDA(A003-1)測試盒購于南京建成生物工程研究所。

1.4.6肝臟抗氧化物酶和丙二醛含量的測定 肝臟樣品室溫解凍后取適量，冰浴條件下制成10%勻漿，3 000 r/min離心10 min后取上清檢測抗氧化酶活性及丙二醛含量。測定方法和試劑盒同1.4.5。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)經(jīng)Excel處理后采用SAS9.2統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，采用Ducan's多重比較處理平均值，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。采用線性回歸分析有機微量元素不同添加水平下的生產(chǎn)性能及微量元素含量等指標(biāo)的一次和二次線性關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 生產(chǎn)性能與IE-100相比，OE-100顯著提高肉雞(1～42 d)的ADG(P<0.05，表3)。與OE-0相比，OE-75肉雞的ADG(22～42 d和1～42 d)顯著提高(P<0.05)，F(xiàn)/G(22～42 d和1～42 d)顯著降低(P<0.05)。肉雞ADG(1～21，1～42，22～42 d)隨著寡二糖鰲合微量元素預(yù)混劑水平降低呈一次和二次線性降低(P<0.05)，而F/G(22～42 d和1～42 d)線性升高(P<0.05)。

表3 寡二糖螯合微量元素對肉雞生產(chǎn)性能的影響(n=100) g/d

2.2 血液鐵、銅、鋅和錳的水平與IE-100相比，OE-100顯著提高肉雞血液鐵(21 d)(P<0.05，表4)。與OE-0相比，IE-100、OE-100、OE-75 、OE-50和OE-25血液鐵(21 d)、鋅和銅(42 d) 顯著提高(P<0.05)。隨著寡二糖鰲合微量元素預(yù)混劑水平降低，肉雞血液鐵(21 d)、鋅(21 d和42 d)、銅(21 d和42 d)和錳(42 d)水平呈現(xiàn)一次和二次線性降低(P<0.05)，本試驗21 d血液錳含量低于檢測限。

2.3 肝臟鐵、銅、鋅和錳存儲量與IE-100相比，OE-100顯著提高肉雞肝臟鐵(21 d)(P<0.05，表5)。與OE-0相比，IE-100、OE-100、OE-75 、OE-50和OE-25顯著提高肉雞肝臟21 d的鐵和42 d的鐵、鋅、銅及錳(P<0.05)。隨著寡二糖鰲合微量元素預(yù)混劑水平降低，肉雞肝臟中鐵和鋅(21 d和42 d)、銅和錳(42 d)存儲量均呈現(xiàn)一次和二次線性降低(P<0.05)。

2.4 血清抗氧化物酶活性和丙二醛含量與IE-100相比，OE-100顯著提高肉雞血清Cu-Zn SOD(42 d)活性(P<0.05，表6)。與OE-0相比，IE-100、OE-100、OE-75 、OE-50和OE-25血清Cu-Zn SOD和GSH-Px(21 d和42 d)的活性顯著升高(P<0.05)，MDA(21 d和42 d)的含量顯著降低(P<0.05)。血清Cu-Zn SOD和GSH-Px的活性(21 d 和42 d)均隨著寡二糖鰲合微量元素預(yù)混劑水平下降呈一次和二次線性降低(P<0.05)，MDA(21 d和42 d)含量則呈一次和二次線性升高(P<0.05)。

表4 寡二糖螯合微量元素對肉雞血液微量元素含量的影響(n=10) g/L

表5 寡二糖螯合微量元素對肉雞肝臟微量元素含量的影響(n=10) mg/kg

表6 寡二糖螯合微量元素對肉雞血清抗氧化能力的影響(n=10)

2.5 肝臟抗氧化物酶活性和丙二醛含量與IE-100相比，OE-100顯著提高肉雞肝臟Cu-Zn SOD(42 d)活性(P<0.05，表7)，MDA(42 d)含量顯著降低(P<0.05)。與OE-0相比，IE-100、OE-100、OE-75和OE-50肝臟Cu-Zn SOD和GSH-Px(21 d和42 d)的活性顯著提高(P<0.05)，MDA含量(42 d)顯著降低(P<0.05)。隨著寡二糖鰲合微量元素預(yù)混劑水平下降，肉雞肝臟Cu-Zn SOD和GSH-Px活性(21 d和42 d)呈一次和二次線性降低(P<0.05)，而MDA含量(42 d)呈一次和二次線性升高(P<0.05)。

表7 寡二糖螯合微量元素對肉雞肝臟抗氧化能力的影響(n=10)

3 討論

3.1 生長性能飼糧中添加有機微量元素能夠促進動物的生長性能。研究表明，用37.5%的蛋氨酸螯合鐵、銅、鋅、錳替代75%的相應(yīng)無機鐵、銅、鋅、錳(按1 mg螯合元素代替2 mg無機元素方式)顯著提高肉雞ADG，降低了料重比[11]。肉雞飼糧中添加果膠低聚糖螯合鋅(600 mg/kg)顯著提高了ADG和ADFI[12]。郭建來等[13]研究表明，飼糧中用蛋白質(zhì)螯合鐵、鋅、銅、錳等量替代全部的對應(yīng)無機微量元素顯著提高‘杜×長×大’三元仔豬的日增體質(zhì)量，料重比也有所下降。CREECH等[14]對斷奶母豬的研究表明，飼糧中用蛋白質(zhì)螯合銅、鋅、錳和鐵等量替代50%的硫酸鹽也顯著提高了日增體質(zhì)量。本試驗中，肉雞飼糧用75%或100%寡二糖鰲合微量元素預(yù)混劑代替全部無機微量元素顯著提高其生產(chǎn)性能，用25%寡二糖鰲合微量元素預(yù)混劑代替全部無機微量元素，肉雞的生產(chǎn)性能差異不顯著,說明25%的寡二糖螯合多元微量元素預(yù)混劑滿足AA肉雞生產(chǎn)性能對微量元素的需要?？赡茉蚴枪讯球隙嘣⒘吭氐尿下矢?，微量元素進入腸道后不以離子的形式存在，而是以寡二糖螯合物的形式被吸收，由于寡二糖螯合物的分子較小，可以更好地吸收入血[15]；同時寡二糖螯合多元微量元素具有親脂性，可以經(jīng)過小腸絨毛刷狀緣，通過氨基酸和小肽途徑通道吸收進入血液，也可以經(jīng)過糖脂、糖蛋白和寡糖通道進入血液[16-17]。微量元素作為酶結(jié)構(gòu)和活性中心的組成部分[18]，通過各種酶促進體內(nèi)三大有機物質(zhì)代謝，進而提高動物的生產(chǎn)性能。但也有研究表明，用不同水平(25,50,75,100 mg/kg)的蛋白質(zhì)螯合鋅對斷奶仔豬的生長性能無明顯的改變[19]。這可能是因為不同的有機微量元素生物學(xué)效價、生產(chǎn)工藝和主要作用機制不同，同時不同動物的不同階段對微量元素的需要量也不一樣[10,15]，在某一劑量范圍內(nèi)，微量元素提高動物機體免疫力和抗氧化能力，未必明顯改善生產(chǎn)性能，但其機制尚需進一步證實。

3.2 微量元素含量血液中微量元素含量反映了機體對微量元素的吸收利用情況[20-21]，經(jīng)過血液循環(huán)之后，主要沉積部位是肝臟[22]。孫秋娟等[23]研究發(fā)現(xiàn)，用等量羥基蛋氨酸螯合銅、錳和鋅替代無機鹽顯著提高蛋雞肝臟中銅、錳和鋅的含量。SEO等[24]研究發(fā)現(xiàn)，肉雞飼糧中隨著蛋氨酸螯合鐵添加量的增加，肝臟中鐵含量顯著增加，且添加量為200 mg/kg時，肝臟中鐵含量達到最高。在豬的研究中發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬飼糧中添加170 mg/kg羥基蛋氨酸銅顯著提高肝臟中銅含量[25]。用有機微量元素鐵、銅、錳和鋅(蛋白鹽形式)代替肥育豬飼糧中等量的對應(yīng)無機微量元素，顯著提高了前期豬血清中鋅的含量，對鐵、銅和錳的含量則無顯著性影響[26]。本試驗中，肉雞飼糧用75%或100%寡二糖鰲合微量元素預(yù)混劑代替全部無機微量元素顯著提高肝臟和血清中鐵含量，肉雞飼糧用50%寡二糖鰲合微量元素預(yù)混劑代替全部無機微量元素，肝臟和血清中鐵、銅、錳和鋅的含量差異不顯著，說明50%的寡二糖螯合微量元素完全可以替代全部無機微量元素。原因可能是微量元素與寡二糖螯合后，形成穩(wěn)定性的螯合物，減輕了微量元素之間的拮抗作用[27-29]；同時寡二糖螯合多元微量元素的生物學(xué)利用率高，螯合環(huán)能夠減少腸道中植酸鹽及其他沉淀劑對微量元素的結(jié)合沉積，很輕易地被腸道中的蛋白質(zhì)受體識別并捕獲，通過小肽和氨基酸的吸收途徑進入血液循環(huán)，并到肝臟中沉積，因而血液和肝臟中微量元素含量升高[22,30-32]。

3.3 抗氧化物酶活性和丙二醛含量GSH-Px和Cu-Zn SOD等是構(gòu)成機體抗氧化應(yīng)激的重要屏障[33]，MDA含量反映了機體的氧化程度。CERONE等[34]研究發(fā)現(xiàn)，銅和鋅的缺乏會影響Cu-Zn SOD酶的活性。薛穎等[35]研究證實，飼糧中添加NRC需要量的25%，50%的羥基氨基酸錳、銅、鋅以及甘氨酸鐵、酵母硒顯著提高血漿的SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量。飼糧中添加120 mg/kg甘氨酸亞鐵可以顯著提高肉雞血清中SOD活性，降低MDA含量[36]。用有機微量元素鐵、銅、錳和鋅(蛋白鹽形式)代替肥育豬飼糧等量的對應(yīng)無機微量元素，可以提高前期豬Mn-SOD活性，降低MDA含量，顯著提高后期豬GSH-Px活性[26]。本試驗中，隨著寡二糖螯合多元微量元素水平下降，肉雞血清和肝臟的Cu-Zn SOD和GSH-Px活性呈一次和二次線性降低，而MDA含量呈一次和二次線性升高。肉雞飼糧用75%寡二糖鰲合微量元素預(yù)混劑代替全部無機微量元素，肉雞血清和肝臟抗氧化能力顯著提高，75%寡二糖鰲合微量元素預(yù)混劑代替全部無機微量元素的抗氧化能力與無機微量元素組十分相當(dāng)，這可能是因為Cu-Zn SOD作為一種銅、鋅依賴酶，受血液和肝臟中銅、鋅含量的影響，同時其活性的增加可能與自身降解穩(wěn)定性的提高或降解速度的減慢有關(guān)，隨著寡二糖螯合多元微量元素被機體吸收后，血液和肝臟中的有效銅和鋅含量升高，Cu-Zn SOD活性也顯著升高，提高了機體抗氧化酶活性和清除體內(nèi)自由基的能力[37-41]，同時體內(nèi)寡糖含量增加，也具有清除體內(nèi)的自由基，提高機體的抗氧化酶活性的能力[42-44]。血清和肝臟試驗21 d的抗氧化酶活性低于42 d，這與動物的生長發(fā)育有關(guān)，也更好地解釋了年齡增長抵抗力強的一個原因。

與無機微量元素處理和不添加微量元素處理相比，100%寡二糖螯合微量元素預(yù)混劑能提高肉雞的生長性能、微量元素含量和抗氧化性能，且能改善肉雞生產(chǎn)性能、元素(銅、鋅、錳和鐵)在血清和肝臟中儲備、血清和肝臟抗氧化性能的最適宜水平分別為25%，50%，75%；與無機微量元素綜合性能相當(dāng)?shù)乃綖?0%～75%。隨著寡二糖螯合微量元素預(yù)混劑添加水平下降，肉雞的生產(chǎn)性能、血液和肝臟的微量元素含量及抗氧化物酶活性大多數(shù)指標(biāo)呈線性下降。