李曼曼，于 昊，薛 洋，茆達干，2*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，江蘇 南京 210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學 動物科學類國家級實驗教學示范中心，江蘇 南京 210095)

顆粒細胞是卵巢的主要功能細胞，其增殖與分化直接影響著卵泡的生長發(fā)育、排卵、黃體形成以及甾體激素分泌等卵巢功能活動。當顆粒細胞離開體內(nèi)環(huán)境時會由于其在排卵前卵泡中的自然命運趨于自然黃素化。補充血清可誘導顆粒細胞增殖，但可影響類固醇的產(chǎn)生和重要功能性基因的表達[1]。采用無血清顆粒細胞培養(yǎng)體系，可維持顆粒細胞對促性腺激素和生長因子的敏感性[2]。

在哺乳動物體內(nèi)，卵泡的發(fā)育和排卵主要受促性腺激素的調(diào)控，尤其是受FSH和LH在卵泡不同發(fā)育階段變化規(guī)律的影響。現(xiàn)已普遍認為，F(xiàn)SH可促進有腔卵泡和排卵前卵泡的生長；少量的LH與FSH協(xié)同能促進卵泡發(fā)育成熟并分泌雌激素。KATSUSHIGE等[3]為了研究LH對小卵泡成熟的作用，應用體外雙細胞系統(tǒng)對牛顆粒細胞和膜細胞進行共培養(yǎng)，結(jié)果顯示添加LH會增加小卵泡對促性腺激素的敏感性，并通過抑制GC凋亡和閉鎖以促進卵泡生長和存活。菅瑞珍等[4]應用血清培養(yǎng)體系結(jié)合生殖激素處理綿羊卵巢顆粒細胞檢測到孕酮水平和標記基因的表達變化。有關(guān)FSH、LH和E2對無血清培養(yǎng)的山羊顆粒細胞的作用卻鮮有報道。因此，本試驗以無血清培養(yǎng)的山羊顆粒細胞為研究對象，應用生殖激素單獨或聯(lián)合處理，分別從孕酮合成、標記基因及蛋白層面研究生殖激素對山羊顆粒細胞孕酮合成的影響，為進一步研究生殖激素在山羊卵巢卵泡-黃體轉(zhuǎn)化中的作用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣本采集從江蘇省丹陽市山羊屠宰場采集剛屠宰的健康山羊卵巢，裝入含有37℃生理鹽水的保溫瓶中，3 h內(nèi)帶回實驗室。參照YAO等[5]方法從卵泡(φ 2～5 mm)中收集卵泡液，臺盼藍染料檢測到細胞活力在90%以上。山羊顆粒細胞以2×105/mL的密度接種到培養(yǎng)瓶中，并在含有0.1% BSA、10-7mol/L雄烯二酮、100X ITS、1%血清、100 IU/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的細胞完全培養(yǎng)基(CCM)中培養(yǎng)48 h備用。

1.2 主要試劑細胞培養(yǎng)液DMEM/F-12、PBS、青霉素和鏈霉素、FBS和ITS-X均購自GIBCO；牛血清白蛋白BSA、牛胰島素、FSH和LH均購自北京索萊寶科技有限公司；雄烯二酮購自上海源葉生物科技有限公司；E2購自SIGMA；孕酮檢測試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所；P450scc抗體(#DF6569)購自Affinity；HSD3B抗體(#ab75710)購自Abcam；CYP19A1抗體(#MCA2077S)購自Bio-Rad；α-Tubulin抗體(#ABM0010)購自Zoonbio Biotechnology；GAPDH(60004-1-Ig)購自Proteintech；羊抗兔、羊抗鼠二抗購自Abclonal Technology；ECL發(fā)光液購自南京諾唯贊生物科技有限公司；BCA試劑盒購自碧云天公司；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A/B)，TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(RR420A)購自TaKaRa；其他試劑均購自南京農(nóng)業(yè)大學試劑部，為國產(chǎn)分析純。

1.3 試驗設(shè)計試驗共分6組，每組3個重復。分離出的山羊顆粒細胞在CCM中培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)液作為添加激素組(0 h)，并將75%體積的培養(yǎng)基換為含有0.1%BSA、1% 血清、2 mg/L牛胰島素、100 IU/mL青霉素和100 mg/L 鏈霉素的分化培養(yǎng)基(LCM)[6]。隨后分6組處理:第1組聯(lián)合添加FSH、LH(終濃度2.5 IU/mL)和 E2(終質(zhì)量濃度1 mg/L)；第2組聯(lián)合添加FSH、LH(終濃度1.25 IU/mL)和E2(終質(zhì)量濃度1 mg/L)；第3組單獨添加FSH(終濃度2.5 IU/mL)；第4組單獨添加LH(終濃度2.5 IU/mL)；第5組單獨添加E2(終質(zhì)量濃度1 mg/L)；第6組不加激素作為對照。

處理24，48，72，96 h后分別收集培養(yǎng)液，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，-20℃凍存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r，收集細胞用于RNA和蛋白的提取。

1.4 孕酮測定采用碘(125I)孕酮放射免疫分析藥盒(北京北方生物技術(shù)研究所)檢測培養(yǎng)液孕酮(P4)濃度，批間差異系數(shù)均小于15%，批內(nèi)差異均小于10%，靈敏度小于0.2 μg/L，由上海信帆生物科技有限公司測定。

1.5 Real-time PCR反應

1.5.1總RNA提取和cDNA合成及質(zhì)量鑒定 利用TRIZOL試劑提取各組細胞的總RNA，通過Nanodrop ND-1000測定其濃度及D260 nm/D280 nm，按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser說明書對RNA進行反轉(zhuǎn)錄，置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2熒光定量RT-PCR引物設(shè)計與合成 基于美國國立生物信息技術(shù)中心(NCBI)和Primer 5.0軟件設(shè)計山羊PTGFR、HSD3B、StAR基因的引物，同時以GAPDH作為內(nèi)參基因，引物序列大小見表1，由南京擎科生物科技有限公司合成。采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

表1 試驗所用引物序列及擴增產(chǎn)物長度

1.6 蛋白免疫印跡法檢測CYP19A1、HSD3B和P450scc蛋白的表達應用RIPA裂解法提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。具體步驟參照ZHANG等[7]進行SDS-PAGE電泳。一抗(HSD3B和P450scc以1∶1 000稀釋，CYP19A1以1∶250稀釋，α-Tubulin以1∶5 000稀釋)4℃孵育過夜；羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，ECL發(fā)光檢測，應用Image J軟件進行灰度分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析試驗數(shù)據(jù)用GraphPad 5.0軟件進行整理，統(tǒng)計結(jié)果以平均數(shù)±標準誤表示，差異顯著性檢驗采用ANOVA的Bonferroni檢驗法進行多重比較。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，0.05

2 結(jié)果

2.1 山羊顆粒細胞培養(yǎng)液中孕酮水平應用FSH、LH和E2聯(lián)合或單獨處理24 h后，F(xiàn)SH/LH/E2(2.5/2.5/1)組的孕酮水平與LH(2.5)組水平相當，均顯著高于其他4組(P<0.01)；然而，在處理48，72，96 h時間點，F(xiàn)SH、LH和E2聯(lián)合或單獨處理組間均無顯著性差異(P>0.05，圖1)。

FSH/LH/E2(2.5/2.5/1)組的孕酮水平在處理后24 h升高不明顯(P=0.151)，但隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸下降，在72，96 h的孕酮水平極顯著低于0，24 h(P<0.01)；FSH/LH/E2(1.25/1.25/1)組與FSH(2.5)組的孕酮水平變化趨勢一致，與0 h相比均在24 h顯著下降(P<0.05)，但48 h又顯著高于24 h(P<0.05)，72，96 h與48 h相比均無顯著性差異(P>0.05)；LH(2.5)組的孕酮水平隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸下降，在96 h顯著下降(P<0.05)；E2(1)組和對照組的孕酮水平均在24 h 顯著下降(P<0.05)，其余時間點無顯著變化。

圖1 生殖激素處理對山羊黃素化顆粒細胞孕酮(P4)水平的影響(字母不同代表差異顯著)

2.2 山羊顆粒細胞PTGFR、HSD3B和StAR基因表達應用FSH/LH/E2(2.5/2.5/1)處理細胞0～96 h，實時熒光定量PCR技術(shù)檢測顆粒細胞黃體化基因PTGFR、HSD3B和StAR的相對表達量。

2.2.1PTGFR表達量 處理24 h的PTGFR表達量極顯著升高(P<0.000 1)，隨后逐漸下降；處理48 h時的基因表達量顯著高于72 h的表達量(P<0.05)，極顯著高于96 h的表達量(P<0.01)；處理72 h的基因表達量顯著高于96 h的表達量(P=0.018)；處理96 h的基因表達量極顯著低于0 h的表達量(P<0.01)(圖2A)。

2.2.2HSD3B表達量 處理24 h的HSD3B表達量極顯著升高(P<0.01)，隨后逐漸下降；處理48 h時的基因表達量極顯著高于72,96 h的表達量(P<0.01)；處理72,96 h的基因表達量極顯著低于0,24 h的表達量(P<0.01)，而處理72，96 h兩組間無顯著性差異(P=0.723)(圖2B)。

2.2.3StAR表達量 處理24 h的StAR表達量極顯著升高(P<0.01)，隨后逐漸下降；處理48 h時的基因表達量極顯著高于72，96 h時的表達量(P<0.01)；處理72 h的基因表達量極顯著低于48 h 的表達量(P<0.01)，且顯著低于0 h的表達量(P=0.033)；處理96 h的基因表達量極顯著低于0 h 的表達量(P<0.01)(圖2C)。

圖2 FSH/LH/E2(2.5/2.5/1)處理山羊顆粒細胞不同時間點的PTGFR、HSD3B和StAR基因表達量(大寫字母不同代表差異極顯著，小寫字母不同代表差異顯著。下同) A.PTGFR/GAPDH;B.HSD3B/GAPDH;C.StAR/GAPDH

2.3 山羊顆粒細胞中P450scc、HSD3B和CYP19A1蛋白的表達FSH、LH和E2聯(lián)合或單獨處理細胞24 h后，應用WB技術(shù)檢測各組細胞P450scc、HSD3B和CYP19A1蛋白表達量(圖3A)。FSH/LH/E2(2.5/2.5/1)組的P450scc蛋白表達量與對照組相比有升高的趨勢(P=0.060 4)，與其他各組相比無顯著性差異(P>0.05，圖3B)；FSH/LH/E2(2.5/2.5/1)組的HSD3B蛋白表達量極顯著高于其他組(P<0.01)，而其他各組間無顯著性差異(P>0.05，圖3C)；而CYP19A1蛋白表達量在6個組間均無顯著性差異(P>0.05，圖3D)。

圖3 生殖激素處理24 h各組P450scc、HSD3B和CYP19A1蛋白的表達量 A.印跡圖；B,C,D.柱狀圖

3 討論

3.1 生殖激素處理對山羊顆粒細胞孕酮分泌水平的影響FSH能夠提高卵巢顆粒細胞增殖活性，促進竇前卵泡顆粒細胞增生，抑制卵泡閉鎖，誘導LHR合成及類固醇激素生成，與LH協(xié)同激發(fā)卵泡成熟排卵并使顆粒細胞轉(zhuǎn)變成黃體細胞[8]。OKTEM等[9]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH處理人有絲分裂非黃素化顆粒細胞系(HGrC1)后，HSD3B活性增加，促進孕酮合成[10]。李贊東等[11]通過體外試驗研究FSH與LH對雞顆粒細胞孕酮分泌的影響，發(fā)現(xiàn)摘除垂體排除內(nèi)源性FSH和LH時孕酮濃度顯著下降，單獨添加FSH或LH時均無促進作用，同時添加FSH與LH時孕酮濃度恢復，表明FSH、LH是顆粒細胞發(fā)生黃體化的主要因素。卵巢合成E2的能力是衡量卵泡功能和活性的主要指標[12]。WILTBANK等[13]推測雌激素可能在顆粒細胞增殖與分化中起重要作用。然而，本試驗中激素聯(lián)合或單獨處理24 h后孕酮水平并未升高，且FSH和E2組反而下降。這可能是因為鋪板后的顆粒細胞由于應激未能立刻完全恢復顆粒細胞特征。這與YENUGANTI等[14]的試驗結(jié)論一致，牛顆粒細胞只有長期培養(yǎng)超過4 d時，才能從鋪板應激中恢復并重新獲得顆粒細胞的特征。

激素處理24 h后 FSH/LH/E2(2.5/2.5/1)組孕酮分泌量高于FSH/LH/E2(1.25/1.25/1)組，可能是由于生理濃度范圍內(nèi)FSH濃度越高刺激顆粒細胞增生的作用越強[15]，而高濃度的FSH會產(chǎn)生異相作用，增加孕酮的產(chǎn)生，導致顆粒細胞黃體化[16]。在牛膜細胞和顆粒細胞的體外共培養(yǎng)系統(tǒng)中，添加FSH 24 h孕酮分泌量呈劑量依賴式增加[17]。因此，本試驗選擇不同濃度的生殖激素處理，結(jié)果與菅瑞珍[18]的研究結(jié)果一致，其應用FSH/LH/E2(2.5/2.5/1)處理綿羊顆粒細胞結(jié)果孕酮分泌達到了綿羊體內(nèi)發(fā)情后2 d卵巢優(yōu)勢卵泡液中的水平。

激素處理24 h 后FSH/LH/E2(1.25/1.25/1)組、FSH(2.5)組和E2(1)組孕酮水平下降可能與培養(yǎng)過程中未補充孕酮合成代謝基質(zhì)如血清等有關(guān)，低劑量FSH和LH短期處理還不足以使顆粒細胞充分黃素化，或者芳香化酶(CYP19A1)將合成的孕酮代謝為雄激素或雌激素。CHESHENKO等[19]發(fā)現(xiàn)，芳香化酶CYP19的表達可以改變雌激素產(chǎn)生的速率進而改變雌激素的水平。LH、FSH和PPARγ通路調(diào)控芳香化酶的轉(zhuǎn)錄水平[20]，即LH和FSH分別通過LHR和FSHR介導芳香化酶的下調(diào)或上調(diào)。激素處理48 h 后FSH/LH/E2(1.25/1.25/1)組、FSH(2.5)組和E2(1)組孕酮水平上升，處理72，96 h孕酮分泌量整體均呈下降趨勢，這可能是由于培養(yǎng)時間的延長，添加的激素活性耗竭，孕酮的合成代謝和活性下降。因為隨著黃體退化，細胞會大量分泌20α羥類固醇脫氫酶將孕酮代謝為20α-羥孕酮[21]。

3.2 生殖激素處理對山羊顆粒細胞類固醇合成酶的影響孕酮合成過程中StAR、P450scc和HSD3B分別負責將膽固醇轉(zhuǎn)運至線粒體內(nèi)部，將膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮以及將孕烯醇酮催化成孕酮[22]，這一過程受到PRL、LH、FSH和E2等激素的調(diào)節(jié)[23]。FSH和LH直接參與卵泡的發(fā)育、排卵、黃體形成和類固醇激素合成[24]。在LH峰之后排卵之前，P450scc、HSD3B mRNA表達暫時性降低；排卵后和黃體化期間其mRNA表達和酶活性升高，孕酮產(chǎn)量增加；黃體完全功能化時P450scc、HSD3B活性進一步增加[24]。體外研究發(fā)現(xiàn)，在虹鱒魚的卵泡中，F(xiàn)SH增加StAR和HSD3B轉(zhuǎn)錄水平[25]。在牛膜細胞和顆粒細胞的體外共培養(yǎng)系統(tǒng)中，F(xiàn)SH 可提高StAR和P450scc mRNA表達量[17]。FSH與TCS(三氯生)共處理鼠顆粒細胞，可升高HSD3B和StAR蛋白水平，而對P450scc蛋白水平無影響[26]。

本試驗中山羊卵巢顆粒細胞聯(lián)合添加FSH/LH/E2(2.5/2.5/1)后，隨著作用時間的延長，StAR基因表達量呈先升高(至24 h)然后下降的趨勢，與HSD3B基因表達模式一致。同樣在激素處理24 h時，HSD3B蛋白在FSH/LH/E2(2.5/2.5/1)組顯著高于其他處理組，這均表明FSH/LH/E2(2.5/2.5/1)對山羊卵巢顆粒細胞分泌孕酮起促進作用。

然而，激素處理24 h后，F(xiàn)SH/LH/E2(2.5/2.5/1)組的P450scc蛋白呈升高趨勢，但與其他處理組無顯著性差異，可能由于顆粒細胞中編碼的膽固醇側(cè)鏈裂解酶P450scc及其催化產(chǎn)物孕烯醇酮可能在短期內(nèi)較為充足，不會限制后續(xù)類固醇的合成，另一方面可能由于24 h的處理時間不足以影響蛋白表達。這與前人的研究一致。LIU等[27]對小鼠和大鼠體外培養(yǎng)的顆粒細胞模型研究發(fā)現(xiàn)，StAR對FSH 的應答極快，3 h后既能檢測到mRNA的上調(diào)，而P450scc應答較為緩慢，在24 h才檢測到mRNA的表達變化。

CYP19A1是細胞色素P450家族成員之一，它用來催化雌激素生成的限速步驟即雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素一步，研究表明，CYP19A1在哺乳動物顆粒細胞中表達[28]。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH能刺激人、大鼠和牛顆粒細胞表達CYP19A1[8]。FSH處理人有絲分裂非黃素化顆粒細胞系(HGrC1)顯著提高HSD3B和 CYP19A1蛋白表達量[18]。在本試驗激素聯(lián)合或單獨處理24 h的CYP19A1蛋白表達無組間差異，與前人研究結(jié)果不一致，可能是由于物種差異或細胞所處的階段不同而引起的。

3.3 生殖激素處理對山羊顆粒細胞PTGFR表達的影響哺乳動物卵巢黃體形成過程中，卵泡膜細胞分化而來的小黃體細胞包含大多數(shù)LHCGR，而顆粒細胞分化而來的大黃體細胞則表達前列腺素(PGF2α)受體(PTGFR)[13]。ROMEREIM等[29]研究發(fā)現(xiàn)，PTGFR作為傳統(tǒng)的黃體細胞標記物，其在大黃體細胞中大量表達，在顆粒細胞、膜細胞和小黃體細胞中極少量表達。排卵前LH峰可顯著增加卵巢卵泡PGE2和PGF2α的濃度，且前列腺素主要是在顆粒細胞中合成[30]。FSH或LH處理刺激鼠顆粒細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導元件—激活轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)合成，進而促進PTGFR基因表達[31]。在體外培養(yǎng)的奶牛子宮內(nèi)膜組織中添加10-12～10-8mol/L E2可上調(diào)奶牛子宮內(nèi)膜組織中PTGFR的mRNA和蛋白表達，促進奶牛子宮內(nèi)膜組織中PGs合成酶的表達，增加 PGE2和PGF2α的分泌合成[32]。這些結(jié)果表明，生殖激素可促進PTGFR基因表達，進而可能增加PGE2和PGF2α的分泌合成，調(diào)節(jié)排卵等生殖功能。

本試驗中FSH/LH/E2(2.5/2.5/1)處理組在山羊顆粒細胞中PTGFR呈現(xiàn)先上升后下降的表達模式，在處理24 h極顯著上升，這可能是因為高濃度的FSH、LH和雌激素誘發(fā)了PGF2α合成，進而使PGF2α的受體PTGFR表達量升高；在處理48,72,96 h PTGFR表達量逐漸下降，且在96 h極顯著低于對照組，這可能是因為雌激素活性下降，進而PTGFR表達量下降。這與前人研究結(jié)果相似，在卵巢切除的大鼠中，所有PTGER和PTGFR基因的mRNA表達被E2下調(diào)[33]。

聯(lián)合添加FSH、LH(終濃度為2.5 IU/mL)和 E2(終質(zhì)量濃度1 mg/L)24 h，有利于體外無血清培養(yǎng)的山羊顆粒細胞合成孕酮，為進一步研究生殖激素在山羊卵巢卵泡-黃體轉(zhuǎn)化中的作用奠定理論基礎(chǔ)。