張 靜，焦熙堯，高曉茜，張 然，甘葉明，李俊杰，李相運(yùn)*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院 河北省牛羊胚胎技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071000；2.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；3上海牧齊牧業(yè)科技有限公司，上海 201514)

綿羊的季節(jié)性發(fā)情和低產(chǎn)羔率是制約規(guī)?；驁隹焖侔l(fā)展的瓶頸，為了人為控制綿羊發(fā)情，縮短世代間隔，減小工作量、簡化管理、提高綿羊繁殖率和產(chǎn)羔率，增加規(guī)模化羊場經(jīng)濟(jì)效益，各個(gè)羊場和牧戶普遍采用定時(shí)輸精技術(shù)[1-3]，即利用外源激素控制和改變空懷母畜卵巢的活動規(guī)律，從而使其在預(yù)定時(shí)間內(nèi)集中發(fā)情、排卵并在固定時(shí)間進(jìn)行輸精的一項(xiàng)技術(shù)。到目前為止，對綿羊定時(shí)輸精技術(shù)的研究主要集中在使用激素的種類、生產(chǎn)廠家、處理方法等，其他方面特別是對于輸精時(shí)間缺乏比較研究[4-6]。綿羊定時(shí)輸精方法通常有2種：一種是開膣器陰道輸精，另一種是腹腔鏡子宮角輸精。前者操作簡便，容易推廣，但母羊需要2次或者3次輸精，工作量大，且公羊使用效率和受胎率(40%～70%)較低。后者只需單次輸精，且公羊使用效率和受胎率高(80%～90%)，但不易推廣、設(shè)備昂貴、對操作人員要求較高、對母羊子宮有損傷，也容易導(dǎo)致多羔(4羔及以上)出現(xiàn)，羔羊成活率降低。因此，當(dāng)務(wù)之急是盡快建立一種簡便高效的綿羊單次定時(shí)陰道輸精技術(shù)。綿羊陰道定時(shí)輸精常見的輸精時(shí)間是在撤栓后36～58 h輸精2次[7-9]。本試驗(yàn)以湖羊和烏珠穆沁羊?yàn)樵囼?yàn)材料，采用單次陰道定時(shí)輸精和腹腔鏡子宮角輸精的方法分別在36，48，58 h各輸精1次，探索綿羊最佳陰道定時(shí)輸精時(shí)間，為簡化綿羊定時(shí)輸精程序、減少工作量及大規(guī)模推廣定時(shí)輸精技術(shù)而提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和動物試驗(yàn)地點(diǎn)有2處，一處是內(nèi)蒙古錫林郭勒盟烏拉蓋管理區(qū)，時(shí)間為2018年8-10月和2019年3-5月，另一處是河北承德圍場，時(shí)間為2018年9月-2019年3月。選擇2～5歲，體質(zhì)量30 kg以上，膘情中等，無生殖道疾病的烏珠穆沁羊(內(nèi)蒙古)和湖羊(河北)作為試驗(yàn)羊。湖羊全部舍飼，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致，每天定時(shí)2次飼喂，粗飼料主要是青貯玉米，精飼料是全價(jià)日糧，粗飼料和精飼料粉碎混合均勻后飼喂。烏珠穆沁羊全部放牧，冬季補(bǔ)飼干草。

1.2 同期發(fā)情陰道埋植海綿栓(含45 mg氟孕酮，SYNCRITE-45 Vaginal Sponge，澳大利亞生產(chǎn))當(dāng)天記為0 d，于13 d撤栓，同時(shí)肌肉注射孕馬血清促性腺激素(PMSG) 330 IU(PMSG，1 000 IU/瓶，寧波三生生物科技有限公司)，分別在撤栓后36，48，58 h輸精。

1.3 定時(shí)輸精采集6～8只杜泊公羊的新鮮精液，混合，加入脫脂牛奶5～7倍稀釋，精子活力0.5以上，精子密度4×108/mL，置30℃水浴中保存。試驗(yàn)羊隨機(jī)分為3組，分別在撤栓后的36，48，58 h輸精。采用陰道輸精時(shí)，試驗(yàn)羊倒立保定，用溫生理鹽水清潔外陰部，插入開膣器打開陰道，觀察并定位子宮頸口，利用綿羊?qū)Ｓ幂斁?保定正木生物科技有限公司生產(chǎn))吸取0.3 mL精液，注入子宮頸口內(nèi)。采用腹腔鏡子宮角輸精時(shí)，試驗(yàn)羊禁食24 h，保定于固定架上，腹部向上，剔除乳房基部及腹部被毛，利用腹腔鏡將0.2 mL精液注入兩側(cè)子宮角，每側(cè)子宮角各0.1 mL。整個(gè)輸精過程在2 h內(nèi)完成。

1.4 促黃體素釋放激素A3處理用生理鹽水稀釋促黃體素釋放激素A3(LRHA3，25 μg/支，寧波三生生物科技有限公司生產(chǎn))，質(zhì)量濃度25 mg/L。根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，輸精完成后，每只試驗(yàn)羊肌肉注射17 μg或25 μg LRHA3。

1.5 妊娠檢查輸精后40 d，由一名固定人員使用B超檢測儀(DP-30Vet，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)經(jīng)腹部對受配母羊進(jìn)行妊娠檢查，B超屏幕顯示明顯孕囊者認(rèn)定為妊娠，以妊娠母羊占受配母羊的百分比計(jì)算受胎率。

1.6 數(shù)據(jù)分析利用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，不同試驗(yàn)組綿羊受胎率之間的顯著性檢驗(yàn)采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)定為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 撤栓后不同時(shí)間單次定時(shí)陰道輸精對湖羊和烏珠穆沁羊受胎率的影響隨機(jī)挑選195只湖羊和201只烏珠穆沁羊，分別在撤栓后36,48,58 h單次陰道輸精1次(表1)，隨著輸精時(shí)間的推遲，湖羊和烏珠穆沁羊的受胎率均顯著提高(P<0.05)，并都在撤栓后的58 h得到最高受胎率(湖羊76.9%，烏珠穆沁羊72.3%)。在相同輸精時(shí)間，湖羊與烏珠穆沁羊之間的受胎率沒有顯著性差異(P>0.05)。

表1 撤栓后不同時(shí)間單次定時(shí)陰道輸精對湖羊和烏珠穆沁羊受胎率的影響

2.2 撤栓后不同時(shí)間腹腔鏡子宮角輸精對湖羊和烏珠穆沁羊受胎率的影響隨機(jī)挑選1 020只湖羊和780只烏珠穆沁羊，分別在撤栓后36，48，58 h 借助腹腔鏡進(jìn)行子宮角輸精(表2)，湖羊和烏珠穆沁羊在 36 h的受胎率顯著低于 48 h和 58 h的受胎率(P<0.05)，而 48 h和 58 h 的受胎率在2個(gè)品種之間以及品種之內(nèi)都沒有顯著性差異(P>0.05)。

2.3 LRHA3對湖羊和烏珠穆沁羊受胎率的影響隨機(jī)挑選786只湖羊和700只烏珠穆沁羊，在撤栓后 58 h，湖羊采用陰道輸精和子宮角輸精，烏珠穆沁羊采用陰道輸精，觀察LRHA3對試驗(yàn)羊受胎率的影響(表3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于湖羊，陰道輸精時(shí)每只羊注射 17 μg或 25 μg LRHA3，受胎率顯著降低(P<0.05)，而在子宮角輸精時(shí)，注射17 μg或25 μg LRHA3對受胎率沒有顯著性影響(P>0.05)；對于烏珠穆沁羊，陰道輸精時(shí)每只羊注射 17 μg或 25 μg LRHA3，受胎率顯著提高(P<0.05)。不同劑量的LRHA3(17 μg和 25 μg)對湖羊和烏珠穆沁羊的受胎率沒有顯著性影響(P>0.05)。

表2 撤栓后不同時(shí)間腹腔鏡子宮角輸精對湖羊和烏珠穆沁羊受胎率的影響

表3 LRHA3對湖羊和烏珠穆沁羊受胎率的影響

2.4 定時(shí)輸精對湖羊和烏珠穆沁羊產(chǎn)羔率的影響本試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)了200只分娩湖羊(子宮角輸精+ LRHA3)和200只分娩烏珠穆沁羊(陰道輸精+LRHA3)的產(chǎn)羔(包括死羔)情況，結(jié)果顯示湖羊有15只羊產(chǎn)單羔、46只羊產(chǎn)雙羔、132只羊產(chǎn)三羔、6只羊產(chǎn)四羔、1只羊產(chǎn)五羔，產(chǎn)羔率266%；烏珠穆沁羊有161只羊產(chǎn)單羔、32只羊產(chǎn)雙羔、5只羊產(chǎn)三羔、2只羊產(chǎn)四羔，產(chǎn)羔率124%。

3 討論

3.1 撤栓后不同時(shí)間定時(shí)輸精顯著影響湖羊和烏珠穆沁羊的受胎率本試驗(yàn)探討了撤栓后不同時(shí)間單次陰道定時(shí)輸精和腹腔鏡子宮角定時(shí)輸精對湖羊和烏珠穆沁羊受胎率和產(chǎn)羔率的影響，同時(shí)也探討了LRHA3在綿羊定時(shí)輸精中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)湖羊和烏珠穆沁羊在撤栓后58 h單次陰道輸精的受胎率顯著高于撤栓后36 h和48 h的受胎率。二者在撤栓后48 h和58 h的腹腔鏡子宮角輸精的受胎率沒有顯著性差異，但也都顯著高于撤栓后36 h的受胎率，這些數(shù)據(jù)表明不管采用何種輸精方法，湖羊和烏珠穆沁羊的適宜輸精時(shí)間是在撤栓后58 h。大多數(shù)關(guān)于綿羊定時(shí)輸精的文獻(xiàn)報(bào)道，輸精時(shí)間都在撤栓后 36～58 h[10-13]，而且撤栓后58 h的受胎率普遍高于36 h和48 h的受胎率[14]。在繁殖季節(jié)，考力代羊埋栓(含300 mg孕酮)6 d，并在撤栓同時(shí)注射PMSG 300 IU和前列腺素 125 μg，采用陰道/子宮頸輸精和腹腔鏡子宮角輸精法，在撤栓后54 h的受胎率為42.3%和56.9%，而在撤栓后48 h的受胎率為31.1%和44.1%，前者顯著高于后者。采用陰道輸精、子宮頸口深部輸精和腹腔鏡子宮角輸精方法，新疆細(xì)毛羊在撤栓后24 h的受胎率分別為38.25%，43.12%和55.20%；在撤栓后72 h的受胎率分別為23.19%，30.45%，52.71%，都顯著低于撤栓后36 h(49.30%，51.54%，59.09%)和48 h(42.83%，50.15%，90.79%)的受胎率[15]。下一步，我們計(jì)劃在撤栓后58 h與72 h之間設(shè)置2個(gè)輸精時(shí)間點(diǎn)以進(jìn)一步觀測湖羊和烏珠穆沁羊的單次定時(shí)陰道輸精的受胎率，確定最佳輸精時(shí)間。單次輸精對于綿羊繁殖有較高風(fēng)險(xiǎn)，關(guān)鍵是確定適宜的輸精時(shí)間和輸精量，這對于綿羊規(guī)模生產(chǎn)中高效繁殖環(huán)節(jié)有重要意義。多浪羊鮮精單次輸精后的產(chǎn)羔率達(dá)78.3%，與本交母羊相比差異不顯著[16]。杜蒙羊撤栓后36 h鮮精輸精2次或3次，受胎率沒有顯著性差異[17]。目前，綿羊定時(shí)輸精多采用2次輸精[8,10-11,18]，個(gè)別地區(qū)也有3次輸精者，但輸精次數(shù)的增多不僅增加了勞動強(qiáng)度，降低了公羊利用率，而且易造成母羊子宮疾患[16]。本試驗(yàn)在撤栓后58 h采用單次定時(shí)陰道輸精方法，沒有試情，既能充分利用優(yōu)秀種公羊的精液，減少勞動量，簡化生產(chǎn)管理流程，又能獲得較高的受胎率和產(chǎn)羔率，適宜在綿羊養(yǎng)殖場(戶)大規(guī)模推廣應(yīng)用。

3.2 促黃體素釋放激素A3(LRHA3)對綿羊定時(shí)輸精受胎率的作用LRHA3是人工合成的一種促性腺激素釋放激素(GnRH)，它能促進(jìn)排卵，提高排卵同期性[3,12]。然而，在綿羊撤栓后的24～44 h注射GnRH，妊娠率并沒有得到提高，如果在單次定時(shí)輸精的同時(shí)注射GnRH還會降低受胎率，在2次注射前列腺素誘導(dǎo)考力代羊同期發(fā)情和定時(shí)輸精時(shí)，在第2次注射前列腺素后的24 h注射GnRH可降低人工輸精后的妊娠率，而在36 h后注射GnRH對妊娠率沒有顯著性影響[7]。在山羊撤栓后的36 h注射GnRH并在48 h輸精，受胎率也沒有顯著性提高[3,12]。本試驗(yàn)中，當(dāng)湖羊采用陰道輸精時(shí)，LRHA3顯著降低受胎率，但采用腹腔鏡子宮角輸精時(shí)，LRHA3卻沒有影響受胎率；當(dāng)烏珠穆沁羊采用陰道輸精時(shí)，LRHA3卻顯著提高受胎率。本試驗(yàn)雖然沒有觀測烏珠穆沁羊在子宮角輸精時(shí)LRHA3的作用，但這些數(shù)據(jù)也足以表明LRHA3的作用可能與諸多因素有關(guān)(如綿羊品種、營養(yǎng)狀況、胎次、年齡、季節(jié)、飼養(yǎng)管理方式等)。在本試驗(yàn)中，湖羊?yàn)槌Ｄ晟犸?，而烏珠穆沁羊?yàn)槌Ｄ攴拍粒@種不同的飼養(yǎng)管理方式可能也會影響LRHA3的作用。此外，在另外一個(gè)試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)LRHA3顯著降低湖羊胚胎移植成功率，這暗示LRHA3在促進(jìn)排卵同期性的同時(shí)可能會抑制早期胚胎附植，下一步還需要設(shè)計(jì)更加精細(xì)的試驗(yàn)以進(jìn)一步了解LRHA3對綿羊定時(shí)輸精受胎率的影響。

3.3 PMSG在綿羊定時(shí)輸精中的作用在綿羊同期發(fā)情和定時(shí)輸精過程中，注射PMSG可增加排卵數(shù)和產(chǎn)羔率[19-20]。在撤栓前 2 d或撤栓同時(shí)注射 PMSG 500 IU 可使奧西米綿羊排卵數(shù)增加到2.33[19]；在撤栓前2 d或1 d或者撤栓同時(shí)注射PMSG 400 IU 可使墨西哥短毛綿羊的排卵數(shù)增加到3.3[21]；對東北細(xì)毛羊分別注射PMSG 1 200,1 000,800 IU，產(chǎn)羔率平均提高至182.6%[22];對甘肅高山細(xì)毛羊埋栓13 d，撤栓同時(shí)注射PMSG 600 IU，產(chǎn)羔率提高至150%[23];在藏綿羊選育核心群，埋栓12 d后撤栓，同時(shí)注射PMSG 500 IU，產(chǎn)羔率為119.27%，繁活率為114.11%[24]。對于山羊，注射PMSG也同樣可以增加排卵數(shù)和產(chǎn)羔率。采用陰道海綿栓和PMSG相結(jié)合的方法，對63只空懷灘羊進(jìn)行處理，結(jié)果表明：配種季節(jié)注射250 IU和非配種季節(jié)注射300 IU PMSG能有效誘導(dǎo)灘羊同期發(fā)情并增加排卵數(shù)，年繁殖率達(dá)187.3%，年只均繁殖成活羔羊1.59只[25]。湖羊和烏珠穆沁羊分別是我國著名的多胎羊和單胎羊品種，湖羊產(chǎn)羔率228.9%，烏珠穆沁羊產(chǎn)羔率100%。本試驗(yàn)中，湖羊和烏珠穆沁羊的產(chǎn)羔率分別達(dá)到266%和124%，顯著高于自然妊娠產(chǎn)羔率，表明同期發(fā)情和定時(shí)輸精技術(shù)可以顯著提高綿羊產(chǎn)羔率。然而，也有報(bào)道認(rèn)為，雖然PMSG能夠增加排卵數(shù)，但卻并不能提高產(chǎn)羔率[21]。杜泊羊注射PMSG 300 IU組與未注射PMSG組的產(chǎn)羔率分別是150%和140%[26]；阿華西羊注射PMSG 600 IU，雖然多胎率有所增加，但總產(chǎn)羔率并沒有顯著提高[27]；這些數(shù)據(jù)表明：卵巢對于PMSG的反應(yīng)可能非常敏感，不同品種之間甚至同一品種不同個(gè)體之間對于同一劑量的PMSG反應(yīng)都不相同，此外，季節(jié)、營養(yǎng)、注射時(shí)間等也會影響PMSG的作用[28]。

在畜牧生產(chǎn)中，定時(shí)輸精是一項(xiàng)非常重要的繁殖管理手段，它既免去了發(fā)情鑒定環(huán)節(jié)，又解決了母畜產(chǎn)后不發(fā)情問題，從而可明顯提高畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。在今后一段時(shí)期內(nèi)，同期發(fā)情與定時(shí)輸精技術(shù)必將成為家畜繁殖技術(shù)研究的熱點(diǎn)[15]。