單志鳴，王文潔，李進香，孫紅啟

鄭州大學附屬兒童醫(yī)院/河南省兒童醫(yī)院/鄭州兒童醫(yī)院鄭州市感染與免疫重點實驗室，河南鄭州 450018

17-α-羥孕酮(17-α-OHP)主要由人腎上腺皮質(zhì)生成，為低孕酮活性，可以經(jīng)21-羥化進一步合成皮質(zhì)醇類激素[1]。育齡女性的17-α-OHP水平隨月經(jīng)周期發(fā)生變化，表現(xiàn)為黃體期高，卵泡期低。妊娠時，胎盤和腎上腺等可以大量生成17-α-OHP，妊娠32周以后17-α-OHP水平驟然升高持續(xù)至分娩期。病理狀態(tài)(如先天性腎上腺皮質(zhì)增生)會引起17-α-OHP水平升高。新生兒臍帶血內(nèi)也可檢測出17-α-OHP[2-3]。磁微?；瘜W發(fā)光法檢測17-α-OHP采用競爭法原理：用二抗包被磁微粒，17-α-OHP抗體制成抗體溶液，將辣根過氧化物酶標記的17-α-OHP抗原制備成酶標結(jié)合物。通過抗原抗體相互反應形成抗體酶標抗原復合物,復合物可催化發(fā)光底物產(chǎn)生光子，發(fā)光值(RLU)強度與17-α-OHP水平呈反比。該方法是一種敏感、特異的快速檢測方法。根據(jù)美國臨床實驗室改進修正案和ISO15189等文件對實驗室質(zhì)量的管理要求和實驗室認可的要求[4-5]，實驗室檢測分析系統(tǒng)在臨床應用前須對其進行分析性能驗證[6-7]。本研究通過分析AutoLumo A2000檢測系統(tǒng)檢測17-α-OHP的精密度、靈敏度、線性范圍、干擾試驗和參考區(qū)間，驗證廠商給定的性能參數(shù)，為臨床應用該項目提供準確、翔實、可靠的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院2019年1-5月就診患者的新鮮血清標本，根據(jù)17-α-OHP水平的高低分開保存，置于-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2儀器與試劑 AutoLumo A2000化學發(fā)光測定儀及檢測試劑盒(豫械注準20142400077)。

1.3方法

1.3.1精密度分析 按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)EP15-A2文件要求[8]，選用高、低兩個水平的安圖生物室內(nèi)質(zhì)控品(QCI和QC2，批號：20171023)進行檢測，評價儀器精密度。每天9：00測定QC1和QC2兩次，15:00測定QC1和QC2兩次，連續(xù)測定10 d，共測得40組數(shù)據(jù)，根據(jù)測定結(jié)果分析批內(nèi)和批間精密度。

1.3.3線性范圍評價 按照CLSI EP6-A文件要求[9]，取17-α-OHP高水平(H)和低水平(L)血清各1份，按4H、3H+1L、2H+2L、1H+3L和4L的比例配制成5個水平的標本，形成系列水平血清進行測定。以稀釋后的理論值為X，實測值為Y，將所有結(jié)果標注在坐標圖上，計算回歸方程Y=αX+β，驗證線性范圍，判斷標準：α為0.97～1.03，線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.990 0。

1.3.5參考區(qū)間 選擇在線性范圍內(nèi)的17-α-OHP高水平標本1份，用系統(tǒng)稀釋液按照說明書最大稀釋倍數(shù)的10倍進行稀釋，檢測稀釋前高水平標本和稀釋后標本各2次，得出靶值(原值的均值)和檢測值(稀釋后標本均值×10)，計算檢測值與靶值的相對偏倚，偏倚=(檢測值-靶值)/靶值×100%。

2 結(jié) 果

2.1精密度驗證結(jié)果 QC1批內(nèi)精密度為2.85%，批間精密度為1.25%，總精密度為2.37%；QC2批內(nèi)精密度為3.25%，批間精密度為2.65%，總精密度為3.51%，均符合CLSI指南要求的標準。

2.3線性范圍驗證結(jié)果 選取17-α-OHP高水平(28.59 ng/mL)和低水平(0.38 ng/mL)血清，稀釋后的理論值X和實測值Y見表1。線性回歸方程結(jié)果顯示，Y=0.971 6X+0.138，R2=0.999 8。根據(jù)α為0.97～1.03，線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.990 0，判斷線性范圍良好。故17-α-OHP水平在廠家給出的線性范圍內(nèi)(0.05～30.00 ng/mL)線性良好。見圖1。

表1 17-α-OHP理論值X和實測值Y比較(ng/mL)

圖1 17-α-孕酮線性回歸分析

2.5參考區(qū)間驗證結(jié)果 原值兩次測定結(jié)果均值為26.98 ng/mL，稀釋標本兩次測定結(jié)果均值為25.81 ng/mL，偏倚為-4.34%，符合標準要求，試劑盒參考范圍滿足0.05～30.00 ng/mL的要求。

表2 干擾試驗結(jié)果(ng/mL)

注：-表示無數(shù)據(jù)。

3 討 論

17-α-OHP是診斷多種臨床疾病的重要指標，主要包括嬰幼兒期的女嬰男性化、厭食、腹瀉、嘔吐、體質(zhì)量下降、代謝性酸中毒、皮膚黏膜色素沉著等。青少年期體格發(fā)育過快、骨齡大于年齡、陰毛早出及性早熟，女童月經(jīng)初潮延遲，多毛癥，原發(fā)性閉經(jīng)，以及成年男女痤瘡、禿頂及不明原因的不孕不育等也需要檢測17-α-OHP[11]。先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥最常見的病因是酶的缺陷，尤其是21-羥化酶缺陷，占90%左右。患者由于21-羥化酶缺乏或活性降低，孕酮和17-α-OHP產(chǎn)物不能催化、轉(zhuǎn)化為去氧皮質(zhì)酮和脫氧皮質(zhì)醇，導致促腎上腺皮質(zhì)激素反饋性分泌增多，刺激腎上腺皮質(zhì)束狀帶增生，使孕酮和17-α-OHP等中間代謝產(chǎn)物水平增高[12-13]。因此，檢測17-α-OHP水平對疾病的診斷和治療效果監(jiān)測具有重大意義。

目前，17-α-OHP實驗室常用檢測方法有放射免疫法、化學發(fā)光法以及高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[14]。放射免疫法的靈敏度和特異度較低，同時會對受檢人員的身體造成傷害，故逐漸被淘汰。2000年左右，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法開始用于類固醇激素檢測，該方法避免了許多干擾因素，是一種新的檢測手段。該方法不僅可作為參考方法，還能被用于許多臨床指標的檢測[15]，但是由于操作困難和成本較高等因素，目前國內(nèi)臨床實驗室應用較少。化學發(fā)光法憑借其高通量和較高的靈敏度、特異度，仍然是實驗室檢測17-α-OHP等激素類指標的常用方法。

實驗室檢測方法都存在誤差，為保證實驗室為臨床提供高質(zhì)量服務，在檢測方法經(jīng)過試驗后、應用于臨床實驗室檢測前和在對原檢測系統(tǒng)進行調(diào)整后，都應對該方法進行嚴格、系統(tǒng)、專業(yè)的分析性能評價，對儀器廠家提供的技術(shù)指標進行性能驗證[16-17]。為此，CLSI出臺了一系列EP文件，本研究依據(jù)部分EP文件對AutoLumo A2000檢測系統(tǒng)進行性能評價，EP15-A2文件作為精密度性能評價方案指南，是目前評價儀器精密度最全面和最有統(tǒng)計學效能的方法；EP7-A2文件為干擾試驗方案指南；根據(jù)EP6-A2文件制訂的線性評價方案是多項式回歸評價方法中具有代表性的方法[18]。本試驗中化學發(fā)光法對黃疸和血脂標本抗干擾能力較強，而在高Hb狀態(tài)下抗干擾能力較弱，建議在臨床報告結(jié)果中注明標本可能存在的干擾因素，提醒臨床注意。精密度是評價檢測系統(tǒng)的主要指標之一，是儀器性能評價的基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示，AutoLumo A2000檢測系統(tǒng)測定17-α-OHP的QC1批內(nèi)精密度為2.85%，批間精密度為1.25%；QC2批內(nèi)精密度為3.25%，批間精密度為2.65%，均符合CLSI指南要求[19]。線性范圍驗證是驗證方法的最高檢測限和最低檢測限之間是否呈線性關(guān)系，有助于發(fā)現(xiàn)儀器、校準品、試劑和操作規(guī)程等方面的誤差來源。本研究通過系列比例稀釋，檢測標本的17-α-OHP水平，對數(shù)據(jù)結(jié)果進行回歸分析，結(jié)果可看出其與多項式的擬合曲線接近重合，所有數(shù)據(jù)幾乎都落在一條直線上，初步判斷最佳的擬合形式為直線，且數(shù)據(jù)精密度較高，證明在該范圍內(nèi)稀釋的幾個點構(gòu)成直線方程。結(jié)果表明，實測值與理論值之間相關(guān)性良好，R2為0.999 8。與之前的研究[19]相比，本研究對AutoLumo A2000檢測系統(tǒng)的17-α-OHP項目進行了系統(tǒng)、全面的性能指標分析，更好地評價了儀器的性能，為臨床應用提供支持。

綜上所述，通過對17-α-OHP測定儀器的精密度、靈敏度、線性范圍、干擾試驗和參考范圍的評價和分析，證實AutoLumo A2000檢測系統(tǒng)應用化學發(fā)光法測定17-α-OHP的靈敏度高、精密度好、結(jié)果準確可靠，性能可達到臨床檢測的要求。