莫雅斯，饒 輝，盛 磊，胡俊杰，鄭國華，2

(湖北中醫(yī)藥大學 1.藥學院、2.中藥資源與中藥復方教育部重點實驗室老年病中藥新產品湖北省協同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430065)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)約占原發(fā)性肝癌的90%，是全球最常見的惡性腫瘤之一，具有預后不良、容易復發(fā)和死亡率高等特點。全球每年新患HCC人數約為75萬人，其中50%發(fā)生于中國，嚴重危害著我國人民的生命健康[1]。但是，目前臨床上現行的標準化治療手段，如索拉菲尼等，僅能延長患者生命3～4個月[2]。因此，尋找新的治療思路對于肝細胞癌患者具有重要的意義。

原癌基因c-Myc是一種轉錄子，能通過調控細胞生長、分化等大量基因的表達，促進腫瘤的惡性轉化和發(fā)展。研究顯示，在人類肝細胞癌樣本中常常伴隨著c-Myc的過表達和異常擴增[3]，并且在小鼠肝細胞癌模型中c-Myc的表達與肝細胞癌的發(fā)展呈正相關[4]。因此，c-Myc可以作為肝細胞癌靶向治療的候選基因之一。蛋白激酶B(proteinkinase B，Akt)/哺乳動物雷帕霉素復合物1(mTOR complex 1，mTORC1)是腫瘤細胞內重要的信號轉導通路之一，在肺癌、肝癌[5,6]等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，能夠調節(jié)細胞生長、增殖、促進細胞周期進展以及參與血管形成等多種功能。

塞來昔布是環(huán)氧化酶-2的選擇性抑制劑，臨床上常用的一種非甾體抗炎藥。近年來，多項研究表明塞來昔布可以抑制多種腫瘤的發(fā)展，如乳腺癌、非小細胞肺癌等、口腔癌等[7-9]。但目前關于塞來昔布對肝細胞癌的作用及其機制研究還較少。Krysan 等[10]和Xia 等[11]報道，塞來昔布可以通過調節(jié)對前列腺素E2或Wnt/β-catenin通路影響其下游基因c-Myc的表達。Kucab等[12]的研究發(fā)現，塞來昔布可以通過抑制Akt的磷酸化,破壞Akt信號通路。以上結果提示塞來昔布對c-Myc和Akt通路具有一定的作用，但其是否能夠通過c-Myc及Akt/mTORC1信號通路影響肝細胞癌的發(fā)展尚未有報道。本研究采用尾靜脈高壓注射法在小鼠體內過表達c-Myc建立肝細胞癌模型，觀察塞來昔布對小鼠肝細胞癌發(fā)展的作用及其機制。

1 材料

1.1 儀器小鼠固定架(Braintree Scientific INC)；低速離心機(德國艾本德)；恒溫搖床(Thermo Scientific)；純水儀(EASY pure UF 07421,Millipore)；顯微鏡(日本 OLYMPUS BX53)；圖像采集系統(tǒng)(日本 OLYMPUS)；酶標儀(美國 Bio Rad 公司 )；電泳儀(美國 Bio Rad 公司)；漩渦混合器(美國 Scientific Industries 公司)；轉膜儀(美國 Bio Rad 公司) 。

1.2 藥品與試劑c-Myc質粒(CHENXIN實驗室構建)；Top10 感受態(tài)細胞(北京康為世紀生物科技有限公司 03690)；質粒大提試劑盒(美國 OMEGA D6926)；免疫組化試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司20422)；p-Akt T308抗體(#13038)、 p-Akt S473抗體(#4060)、p-4EBP1(#2855)均購自CST公司；c-Myc抗體(10828-1-AP)；β-actin(HRP-6008)及二抗(SA00001-2)購自武漢三鷹生物技術有限公司；塞來昔布(輝瑞制藥有限公司 J20140072)；PVDF 膜(美國 Millipore公司 R9EA33171) 。

1.3 實驗動物SPF級野生型FVB/N小鼠28只，♀，6～7周齡，體質量(18～20) g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0002。

2 方法

2.1 c-Myc誘導小鼠肝細胞癌模型的制備按照質粒提取試劑盒步驟提取 c-Myc基因質粒及編碼 Sleeping Beauty 轉座酶的質粒SB。將c-Myc 基因質粒與SB質粒按25 ∶1的稀釋比例，稀釋到 0.9%氯化鈉溶液中，渦旋混勻，過0.22 μm 微孔濾膜，將配置好的質粒經小鼠尾靜脈迅速(5～9 s)注射入小鼠體內。

2.2 實驗動物分組和給藥適應性飼養(yǎng)1周后，將小鼠隨機分為4組，分別為正常組(WT)，c-Myc模型組，塞來昔布低、高劑量組，每組7只。模型組和給藥組按“2.1項”下方法進行小鼠高壓尾靜脈注射c-Myc質粒，正常組高壓尾靜脈注射生理鹽水作為對照。各組藥物溶液均以水為溶劑配制，現配現用，用前搖勻。造模3 d后塞來昔布低、高劑量組每天灌胃塞來昔布一次，給藥劑量分別為150 mg·kg-1(c-Myc-Cele-L)、300 mg·kg-1(c-Myc-Cele-H)；正常組和c-Myc模型組灌胃等體積空白溶劑，連續(xù)給藥6周。

2.3 樣本收集實驗小鼠在最后一次給藥3 h后，以頸椎脫臼法處死小鼠，解剖，取出完整肝臟組織；拍照并記錄肝重，計算肝臟指數(肝臟指數=肝重/體重)；取部分肝組織用多聚甲醛(4%)固定供組織病理分析；剩余肝臟組織-80 ℃保存。

2.4 蘇木精-伊紅(HE)檢測將在多聚甲醛中固定24 h后的肝組織轉移至75%的酒精中，經自動組織脫水機脫水、透明處理，在石蠟包埋機中浸蠟、包埋，進行厚5 μm 切片，37 ℃水浴展開、撈片、瀝干、常規(guī)HE染色，在顯微鏡下觀察各組小鼠組織病理學變化。

2.5 IHC檢測將包埋后的小鼠肝臟組織切成5 μm厚度切片，按免疫組化試劑盒操作步驟，檢測Ki67蛋白表達情況。

2.6 Western Blot檢測取出-80 ℃凍存的肝臟組織適量，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，超聲破碎后置于冰上充分裂解15 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，然后吸取上清，采用BCA法測蛋白濃度。以等量總蛋白上樣、電泳、轉膜、封閉，置于c-Myc、p-Akt T308、p-Akt S473、p-4EBP1(稀釋比例1 ∶1 000)或β-actin(稀釋比例1 ∶10 000)單克隆抗體溶液中4 ℃孵育過夜，TBST洗膜10 min×3，相應二抗(稀釋比例1 ∶8 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3，ECL顯色后，成像系統(tǒng)進行曝光。用Image J 1.8.0軟件進行分析，以目標蛋白與內參(β-actin)灰度值的比值進行評價。

3 結果

3.1 塞來昔布對c-Myc誘導小鼠肝細胞癌模型肝臟形態(tài)學、肝重、肝臟指數的影響各組小鼠肝臟形態(tài)學變化，如Fig 1A所示。WT組小鼠肝臟外觀呈現鮮紅色，表面光滑質地均勻；c-Myc誘導小鼠肝臟體積明顯增大，肝臟組織出現大量白色結節(jié)；與c-Myc誘導小鼠相比，c-Myc-Cele-L和c-Myc-Cele-H小鼠肝臟體積明顯減小，肝臟組織白色結節(jié)變少。

如Fig 1B、C所示，與WT相比，c-Myc模型組小鼠肝重和肝臟指數均明顯增高(P<0.01)；與c-Myc模型組相比，c-Myc-Cele-L和c-Myc-Cele-H小鼠肝臟重量和臟器指數均明顯降低(P<0.05,P<0.01)，并且呈現一定的劑量效應關系。

3.2 塞來昔布對c-Myc誘導小鼠肝細胞癌模型肝臟組織的病理學影響Fig 2的HE染色結果顯示，WT小組小鼠組織結構清晰，細胞核清晰且均勻分布，胞漿豐富；c-Myc模型組小鼠肝臟組織結構被破壞，細胞核排列緊密且分布散亂(多核、固縮)，幾乎不見胞質； c-Myc-Cele-L和c-Myc-Cele-H小鼠肝臟組織病變減輕，細胞結構較清晰，細胞核變小、多核細胞明顯減少，肝細胞內充滿少量胞質，且c-Myc-Cele-H組腫瘤病變區(qū)域外可見正常組織區(qū)域。

3.3 塞來昔布對c-Myc誘導小鼠肝細胞癌模型肝臟組織中Ki67蛋白表達的影響Ki67在多種惡性腫瘤中呈過表達現象。其與細胞有絲分裂密切相關，是評價腫瘤細胞是否異常增殖的有效指標。Fig 3的Ki67免疫組化染色結果顯示，與WT比較，c-Myc模型組可見大量細胞核Ki67陽性染色；與c-Myc模型組相比， c-Myc-Cele-L和c-Myc-Cele-H組Ki67陽性染色明顯減少，并且呈現一定的劑量效應關系。

3.4 塞來昔布對c-Myc誘導小鼠肝臟組織中c-Myc蛋白表達的影響在c-Myc誘導小鼠肝細胞癌模型中，c-Myc對肝細胞癌的發(fā)生和發(fā)展具有重要影響，因此我們檢測了小鼠肝臟中c-Myc的表達。如Fig 4所示，c-Myc組小鼠肝臟組織中c-Myc蛋白表達與WT組比較明顯增高(P<0.01,P<0.01)；與c-Myc組小鼠相比，塞來昔布干預后(c-Myc-Cele-L和c-Myc-Cele-H)小鼠肝臟組織中c-Myc表達量明顯降低(P<0.05,P<0.01)。

3.5 塞來昔布對c-Myc誘導小鼠肝臟組織中p-Akt T308、p-Akt S473、p-4EBP1蛋白表達的影響如Fig 5 所示，與WT相比，c-Myc組小鼠肝臟組織中p-Akt T308、p-Akt S473、p-4EBP1蛋白表達明顯增高(P<0.05)；與c-Myc組相比，塞來昔布干預后(c-Myc-Cele-L和c-Myc-Cele-H)小鼠肝臟組織中上述蛋白表達量均明顯降低(P<0.01)。

Fig 1 Effects of celecoxib on liver gross image (A),hepatic weight (B) and liver index (C) in

##P<0.01vsWT,*P<0.05,**P<0.01vsc-Myc

Fig 2 Effect of celecoxib on pathological changes of liver tissues(scale bar=100 μm)

Fig 3 Effect of celecoxib on distribution of Ki67 by immunohistochemistry(scale bar=50 μm)

Fig 4 Effect of celecoxib on expression of c-Myc protein in mouse liver

##P<0.01vsWT;**P<0.01vsc-Myc

Fig 5 Effect of celecoxib on expression of p-Akt T308,p-Akt S473 and p-4EBP1 in mouse liver

#P<0.05,##P<0.01vsWT,*P<0.05,**P<0.01vsc-Myc

4 討論

HCC是一種高致死率的腫瘤，其發(fā)病率逐漸上升，目前仍缺乏有效的治療方法。因此，迫切需要尋找新的治療手段來治療肝細胞癌。塞來昔布臨床上主要用于緩解骨關節(jié)炎、類風濕關節(jié)炎以及成人急性疼痛等，近年來研究顯示其具有強大的抗腫瘤活性。Liu等[13]發(fā)現，塞來昔布能夠抑制IL-6/IL-6受體誘導的人肝細胞癌的JAK2/STAT3磷酸化。Tang等[14]研究表明，塞來昔布可以通過阻滯細胞周期抑制肝細胞癌的發(fā)展。但塞來昔布對肝細胞癌的作用及其機制仍有待進一步研究。本研究采用高壓尾靜轉染技術在小鼠體內過表達c-Myc，能激活Akt/mTORC1信號通路，并在6～7周迅速形成肝細胞癌模型[15]。該造模方法具有成模率高、造模周期短等特點，并已廣泛運用于多種肝臟疾病的研究。結果表明，塞來昔布干預能夠明顯的減少c-Myc誘導小鼠的肝重和肝臟指數。說明塞來昔布能夠延緩c-Myc誘導小鼠肝細胞癌發(fā)展。

為進一步明確塞來昔布對c-Myc誘導小鼠肝細胞癌的作用，我們通過HE和IHC檢測塞來昔布對小鼠肝細胞癌的影響。結果顯示，在HE染色中，c-Myc誘導小鼠肝臟組織病變明顯，細胞核排列緊密且分布散亂(多核、固縮)，幾乎不見胞質；塞來昔布干預后上述現象明顯改善，且高劑量組腫瘤病變區(qū)域外可見正常組織區(qū)域。IHC實驗中，c-Myc誘導小鼠肝臟組織腫瘤區(qū)增殖標記物Ki67表達水平明顯升高，塞來昔布干預后Ki67表達水平下降。提示塞來昔布可能通過抑制c-Myc誘導小鼠肝細胞癌的增殖來延緩肝細胞癌的發(fā)展，但其抑制小鼠肝細胞癌異常增殖的作用機制并不清楚。

腫瘤細胞的異常增殖不僅受細胞生長信號的影響，它還通過影響細胞生長周期和細胞凋亡等方式來避免細胞進入最終的分化過程。c-Myc是一種多功能核磷蛋白，屬于堿性螺旋環(huán)螺旋亮氨酸拉鏈家族,通過調控細胞的生長等影響肝細胞癌的發(fā)生與發(fā)展。研究表明，抑制c-Myc的表達可抑制肝細胞癌細胞系(HCC-9204、HepG2等)的增殖。Akt在細胞的存活和凋亡中起著重要作用，p-Akt T308、p-Akt S473是Akt的活性形式。Akt的活化可以激活其主要下游靶點mTORC1。mTORC1是細胞生長、代謝和生存的主要調節(jié)因子。mTORC1的激活可以磷酸化真核細胞翻譯起始子4E 結合蛋白 1(e IF4E-binding protein 1，4EBP1)，從而調節(jié)蛋白合成，影響腫瘤異常增殖。本研究Western blot結果顯示，c-Myc誘導小鼠肝臟中c-Myc、p-Akt T308、p-Akt S473、p-4EBP1蛋白的表達量明顯升高，說明c-Myc以及Akt/mTORC1信號通路在肝細胞癌模型中被激活，與文獻報道一致。塞來昔布可以抑制該模型小鼠肝臟組織中c-Myc、p-Akt T308、p-Akt S473、p-4EBP1蛋白的表達水平。以上結果說明，塞來昔布可能通過調控c-Myc和Akt/mTORC1信號通路來抑制小鼠肝細胞癌的增殖。

綜上所述，塞來昔布能通過抑制c-Myc誘導的小鼠肝細胞癌的增殖來延緩肝細胞癌的發(fā)展，其作用機制可能與塞來昔布能調控c-Myc和Akt/mTORC1信號通路有關。本研究通過c-Myc誘導的小鼠肝細胞癌模型闡明了塞來昔布對肝細胞癌新的作用機制，為肝細胞癌的預防與治療提供了新的思路。