蔣 晴，羅 煜，朱正文，梁雨生，吳嘉思，蘇絲雨，曾 勇，孟憲麗，王 平

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137)

黃芩苷和小檗堿分別是清熱解毒藥黃芩和黃連及其復(fù)方口服后主要的入血成分[1]，二者體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均表現(xiàn)出良好的抗炎活性[2,3]，但聯(lián)合應(yīng)用的合理性研究還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究黃芩苷和小檗堿聯(lián)合對(duì)經(jīng)典炎癥通路關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的影響，評(píng)價(jià)二者合用相關(guān)機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞小鼠腹腔巨噬細(xì)胞株(RAW 264.7)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物與試劑黃芩苷(批號(hào)AF7061702)、鹽酸小檗堿(批號(hào)AF8011015)、穿心蓮內(nèi)酯(批號(hào)AF7072353)，購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α) 檢測(cè)試劑盒(批號(hào)A28281022)、白介素-6(IL-6)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)A20680724)，購(gòu)自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；一氧化氮(NO)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)S0021，碧云天生物研究所)；磷酸化蛋白核因子κB p65(phospho- nuclear factor kappa B p65，p-p65)、p65、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)抗體(美國(guó)Cell Signaling 公司)。

1.3 儀器AE2000雙目顯微鏡(Motic)；二氧化碳培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀(Thermo Scientific)；蛋白垂直電泳儀(Bio-Rad)。

Tab 1 Drug concentration table

Bai: baicalin. Ber: berberine.

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)采用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)RAW 264.7細(xì)胞。

2.2 細(xì)胞分組、給藥、取樣及炎癥關(guān)鍵指標(biāo)的檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞于24孔板，分組含：空白對(duì)照組、模型組(LPS=100 ng·mL-1)、陽性藥物組(LPS+穿心蓮內(nèi)酯10 μmol·L-1)、各劑量給藥組(LPS+聯(lián)合藥物、LPS+黃芩苷、LPS+小檗堿)，給藥濃度見表1。給藥30 min后除空白孔外每孔加入LPS造模，各平行板LPS分別刺激50 min、4 h、12 h后，吸取培養(yǎng)上清液，用于TNF-α、IL-6、NO的檢測(cè)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞于6孔板，同上方各濃度分組操作。分別于LPS刺激2 h、12 h后，提取和變性蛋白，用于p-p65、iNOS的檢測(cè)。

按試劑盒說明書操作測(cè)定細(xì)胞因子水平，通過Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。

2.3 藥物聯(lián)合作用評(píng)價(jià)Chou-Talalay[4]的中效方程是一種能準(zhǔn)確分析藥物配伍使用效果有無協(xié)同、拮抗或加和的定量分析法，如實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不呈對(duì)數(shù)線性關(guān)系，以fa/fu值對(duì)劑量梯度作圖，可直觀得出結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)對(duì)所得三組fa/fu—?jiǎng)┝筷P(guān)系圖評(píng)測(cè)，評(píng)價(jià)二者的聯(lián)合作用。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法通過SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，處理組間差異性。

3 結(jié)果

3.1 蛋白表達(dá)測(cè)定結(jié)果小檗堿在實(shí)驗(yàn)劑量下呈劑量依賴性地抑制NF-κB的磷酸化 (P<0.05)，對(duì)iNOS表達(dá)無相關(guān)作用；而黃芩苷對(duì)NF-κB磷酸化、iNOS表達(dá)的抑制作用極微弱；fa/fu—?jiǎng)┝筷P(guān)系圖顯示聯(lián)用對(duì)NF-κB磷酸化的抑制具有拮抗作用，對(duì)iNOS表達(dá)的抑制呈現(xiàn)加和作用。

3.2 細(xì)胞因子水平測(cè)定結(jié)果黃芩苷呈劑量依賴性地抑制NO的釋放，最高濃度下對(duì)IL-6的釋放具有一定抑制作用(P<0.05 )；小檗堿在實(shí)驗(yàn)劑量下對(duì)NO、IL-6的釋放無相關(guān)抑制作用；二者對(duì)TNF-α均具有微弱的抑制作用；fa/fu—?jiǎng)┝筷P(guān)系圖顯示，二者合用對(duì)NO釋放的抑制表現(xiàn)為加和作用，對(duì)IL-6、TNF-α釋放的抑制呈現(xiàn)較弱的拮抗作用。

4 討論

黃芩苷和小檗堿在單味藥及復(fù)方中均有良好吸收，是發(fā)揮療效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，從二者合用的藥效改變可探索復(fù)方的組織機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)通過相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)資料[1,5]確定黃芩苷和小檗堿的摩爾濃度配比為49 ∶1，以反映二者在體內(nèi)出現(xiàn)的分子比的現(xiàn)實(shí)情況，對(duì)炎癥通路關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[6,7]的影響測(cè)定發(fā)現(xiàn)，黃芩苷和小檗堿聯(lián)用對(duì)抑制p65磷酸化及TNF-α、IL-6釋放均存在一定拮抗作用，可能由于二者結(jié)合導(dǎo)致擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)入胞內(nèi)的總有效成分降低；更重要的是，兩者合用時(shí)小檗堿對(duì)抑制NF-κB p65靶點(diǎn)起主導(dǎo)作用，而黃芩苷對(duì)抑制IL-6、iNOS及NO釋放起主導(dǎo)作用，提示在復(fù)方應(yīng)用中，黃芩苷和小檗堿并非通過共同干預(yù)同一靶標(biāo)發(fā)揮協(xié)同作用，而是側(cè)重于調(diào)控不同靶點(diǎn)，影響不同分子網(wǎng)絡(luò)，互補(bǔ)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)從而發(fā)揮網(wǎng)絡(luò)協(xié)同效應(yīng)，這可能也是中藥組方配伍精髓所在。