王 媛,惠 雙,張成輝,郭宏強(qiáng),李 敏,鄭芝欣

(1.南陽市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 南陽 473000; 2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤綜合病區(qū)，河南 鄭州 450000；3. 南陽市中心醫(yī)院藥學(xué)室，河南 南陽 473000)

NK/T細(xì)胞淋巴瘤屬于非霍奇金淋巴瘤，多起源于結(jié)節(jié)外部位。結(jié)節(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤在亞洲、尤其是中國南方及東南亞地區(qū)發(fā)病率較高[1]。NK/T細(xì)胞淋巴瘤的具有浸潤性生長的特征，病灶內(nèi)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的異常與該病理特征密切相關(guān)[2-3]，但具體的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。傳統(tǒng)治療侵襲性非霍奇金淋巴瘤的CHOP方案用于NK/T細(xì)胞淋巴瘤治療的效果較差，即使能夠獲得短暫緩解、隨后的復(fù)發(fā)率也較高，目前臨床上仍缺乏有效的靶向治療NK/T細(xì)胞淋巴瘤的手段[4]。

白細(xì)胞介素-12(interleukin-12，IL-12)是體內(nèi)重要的免疫活性細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)Th1細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的分化及相應(yīng)細(xì)胞因子的分泌，已經(jīng)在肺癌、乳腺癌、肝癌等惡性腫瘤細(xì)胞中被證實具有抗癌作用[5-7]。在不同類型的淋巴瘤患者中，血清IL-12含量的改變與預(yù)后不佳密切相關(guān)[8]。為了明確IL-12在NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的治療價值，本實驗以NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株YTS為對象，通過細(xì)胞實驗及移植瘤動物實驗分析了IL-12調(diào)控YTS細(xì)胞的細(xì)胞活力、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株YTS，購自中科院上海細(xì)胞資源中心。

1.1.2動物 SPF級的C57小鼠、♂、(18～20) g購自上海杰思捷實驗動物有限公司，許可證號：生產(chǎn)許可SCXK(滬)2018-0004。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(18～23) ℃、適度45%～55%、自由飲水?dāng)z食。

1.1.3試劑 IL-12(批號：SRP3204)購自Sigma公司，DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清購自Gibco公司，陰性對照(NC)siRNA、JAK2 siRNA購自上海吉瑪公司，空白的pcDNA3.1質(zhì)粒、表達(dá)JAK2的pcDNA3.1質(zhì)粒購自上海生工公司，MTS細(xì)胞活力檢測試劑盒(批號：G3580)購自Promega公司，Annexin V/PI凋亡試劑盒(批號：C1062)、RIPA裂解液(批號：P0013)購自上海碧云天公司，結(jié)晶紫購自Sigma公司，JAK2(批號：3230)、p-JAK2(批號：3771)、STAT3(批號：9139)、p-STAT3(批號：9145)的單克隆抗體購自CST公司，β-actin(批號：ab179467)的單克隆抗體購自Abcam公司。

1.1.4儀器 細(xì)胞培養(yǎng)基購自Thermo公司，正置顯微鏡及倒置顯微鏡購自O(shè)lympus公司，電泳系統(tǒng)及化學(xué)顯影儀購自上海天能公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 YTS細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞鋪滿90%后用胰蛋白酶進(jìn)行消化、傳代，傳代后的細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)，得到足夠數(shù)量的細(xì)胞后進(jìn)行分組。對照組用不含藥物的DMEM處理，IL-12組用含有不同濃度IL-12(0.625、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0 ng·mL-1)的DMEM處理，NC siRNA組轉(zhuǎn)染NC siRNA，JAK2 siRNA組轉(zhuǎn)染JAK2 siRNA，空白質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染空白的pcDNA3.1質(zhì)粒，20.0 μg·L-1IL-12+空白質(zhì)粒組用含有20.0 μg·L-1IL-12的DMEM處理并轉(zhuǎn)染空白的pcDNA3.1質(zhì)粒，20.0 μg·L-1IL-12+JAK2表達(dá)質(zhì)粒組用含有20.0 μg·L-1IL-12的DMEM處理并轉(zhuǎn)染表達(dá)JAK2的pcDNA3.1質(zhì)粒。連續(xù)處理24小時。

1.2.2移植瘤小鼠模型建立及分組 取傳代的YTS細(xì)胞、制備濃度為5×107個/mL的細(xì)胞懸液，將0.2 mL細(xì)胞懸液接種在右側(cè)腋窩皮下，7天后捫及米粒大小的腫瘤、提示移植瘤小鼠制備成功，共12只小鼠進(jìn)行移植瘤制備、制備成功率100%。移植瘤小鼠隨機(jī)分為對照組、IL-12組，每組各6只。參照Chi[9]的研究，皮下注射YTS細(xì)胞后d 7、9、12、15、19、25時，IL-12組分別給予1 500 U重組人IL-12瘤內(nèi)注射，第35天時處死、解剖移植瘤并稱重，而后將移植瘤用液氮冷凍、-80 ℃保存。

1.2.3細(xì)胞活力檢測 在96孔板內(nèi)接種YTS細(xì)胞，按照分組及給藥方法分為對照組、IL-12組、NC siRNA組、JAK2 siRNA組、空白質(zhì)粒組、20.0 μg·L-1IL-12+空白質(zhì)粒組、20.0 μg·L-1IL-12+JAK2表達(dá)質(zhì)粒組并進(jìn)行處理，處理24 h后，向每個培養(yǎng)孔內(nèi)加入20 μL MTS試劑盒的檢測液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后取出培養(yǎng)板，震蕩后在酶標(biāo)儀上測定570 nm波長的吸光值、記為OD570。

1.2.4細(xì)胞周期檢測 在6孔板內(nèi)接種YTS細(xì)胞，按照分組及給藥方法分為對照組、IL-12組、NC siRNA組、JAK2 siRNA組、空白質(zhì)粒組、20.0 μg·L-1IL-12+空白質(zhì)粒組、20.0 μg·L-1IL-12+JAK2表達(dá)質(zhì)粒組并進(jìn)行處理，處理24 h后，用70%乙醇固定細(xì)胞過夜，第二天用50 mg·L-1的碘化丙啶、0.1% Triton X-100避光孵育細(xì)胞30 min，最后在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞周期。

1.2.5細(xì)胞凋亡檢測 按照1.2.3的方法收集細(xì)胞并固定過夜，用Annexin V/PI凋亡試劑盒中的檢測液避光孵育15 min，在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.6Western blot檢測 在12孔板內(nèi)接種YTS細(xì)胞并分組處理24 h，收集細(xì)胞并加入RIPA裂解液提取蛋白，在SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳、電轉(zhuǎn)移至NC膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后加入1 ∶1 000稀釋的p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3一抗或1 ∶5 000稀釋的β-actin一抗，4 ℃孵育過夜。次日，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗并在室溫孵育1 h，洗膜后加入顯影液、在化學(xué)顯影儀中曝光得到蛋白條帶，用ImageJ軟件掃描條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參、計算蛋白表達(dá)水平。

1.2.7統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS20.0軟件對組間數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 IL-12對YTS細(xì)胞活力、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響為了研究IL-12的抗NK/T細(xì)胞淋巴瘤活性，本實驗培養(yǎng)了YTS細(xì)胞并用不同濃度的IL-12進(jìn)行干預(yù)。如Fig 1A所示，與對照組比較，0.625 μg·L-1、1.25 μg·L-1IL-12干預(yù)后的細(xì)胞活力OD570值無顯著變化(P>0.05)，2.5 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1IL-12干預(yù)后的細(xì)胞活力OD570值顯著減低(P<0.05)，說明2.5 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1的IL-12能夠抑制YTS細(xì)胞的生長，后續(xù)選用2.5 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1的IL-12繼續(xù)進(jìn)行實驗。

細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡是與細(xì)胞生長活力密切相關(guān)的生物學(xué)環(huán)節(jié)，YTS細(xì)胞的細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡檢測如Fig 1B和1C所示：2.5 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1IL-12干預(yù)后，YTS細(xì)胞中G0/G1期比例以及凋亡率均顯著升高(P<0.05)、S期比例顯著降低(P<0.05)、G2/M期比例無顯著變化(P>0.05)，說明IL-12能夠使YTS細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯、促進(jìn)YTS細(xì)胞的凋亡。

2.2 IL-12對YTS細(xì)胞中JAK2/STAT3通路的影響JAK2/STAT3通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞活力、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的重要信號通路，為了明確IL-12發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的機(jī)制，本實驗在不同濃度IL-12干預(yù)后、通過Western blot檢測了p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)，結(jié)果如Fig 2所示，2.5 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1IL-12干預(yù)后，YTS細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，說明IL-12能夠抑制YTS細(xì)胞中JAK2/STAT3通路的激活。

A: IL-12 inhibited the viability of YTS cells(1:Control group; 2: 0.625 μg·L-1IL-12; 3: 1.25 μg·L-1IL-12; 4: 2.5 μg·L-1IL-12; 5: 5.0 μg·L-1IL-12; 6: 10.0 μg·L-1IL-12; 7: 20.0 μg·L-1IL-12); B: IL-12 inhibited the cell cycle of YTS cells(1:Control group; 2: 5.0 μg·L-1IL-12; 3: 10.0 μg·L-1IL-12; 4: 20.0 μg·L-1IL-12); C: IL-12 induced the apoptosis of YTS cells.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.3 轉(zhuǎn)染JAK2 siRNA對YTS細(xì)胞活力、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響IL-12能夠抑制YTS細(xì)胞中JAK2/STAT3通路的激活，為了驗證JAK2/STAT3通路受抑制后是否影響YTS細(xì)胞的細(xì)胞活力、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡，本使用通過轉(zhuǎn)染JAK2 siRNA的方式來抑制JAK2的表達(dá)，結(jié)果如Fig 3A及3B所示，轉(zhuǎn)染JAK2 siRNA后YTS細(xì)胞中JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3。

在轉(zhuǎn)染JAK2 siRNA、抑制JAK2及STAT3的表達(dá)后，本實驗檢測了細(xì)胞活力、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡，結(jié)果如Fig 3C、3D所示，與對照組及NC siRNA組比較，JAK2 siRNA組的細(xì)胞活力OD570值、S期比例顯著減低(P<0.05)，G0/G1期比例、凋亡率均顯著升高(P<0.05)，G2/M期比例無顯著變化(P>0.05)，說明抑制JAK2的表達(dá)能夠使YTS細(xì)胞的細(xì)胞活力降低、細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞凋亡增強(qiáng)。

2.4 轉(zhuǎn)染JAK2表達(dá)質(zhì)粒對IL-12調(diào)節(jié)YTS細(xì)胞活力、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響為了驗證JAK2/STAT3通路在IL-12調(diào)節(jié)YTS細(xì)胞活力、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡中的作用，本實驗在用20.0 μg·L-1IL-12干預(yù)的同時轉(zhuǎn)染了JAK2表達(dá)質(zhì)粒。與空白質(zhì)粒組比較，20.0 μg·L-1IL-12+空白質(zhì)粒組的p-JAK2、p-STAT3表達(dá)量及細(xì)胞活力OD570值、S期比例顯著減低(P<0.05)，G0/G1期比例、凋亡率均顯著升高(P<0.05)，G2/M期比例無顯著變化(P>0.05)；與20.0 μg·L-1IL-12+空白質(zhì)粒組比較，20.0 μg·L-1IL-12+JAK2表達(dá)質(zhì)粒組的p-JAK2、p-STAT3表達(dá)量及細(xì)胞活力OD570值、S期比例、G2/M期比例顯著增加(P<0.05)，G0/G1期比例、凋亡率均顯著降低(P<0.05)。說明IL-12對YTS細(xì)胞活力、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)作用部分由JAK2/STAT3通路介導(dǎo)。見Fig 4。

Fig 2 Effect of IL-12 on f p-JAK2, p-STAT3 expression in YTS

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Fig 3 Effect of JAK2 siRNA on viability, cell cycle, apoptosis of YTS

A: Transfection of JAK2 siRNA inhibited the expression of JAK2 and STAT3 in YTS cells; B: Transfection of JAK2 siRNA inhibited the viability of YTS cells; C: Transfection of JAK2 siRNA inhibited the cell cycle of YTS cells; D: Transfection of JAK2 siRNA induced the apoptosis of YTS cells.**P<0.01vscontrol group.##P<0.01vsNC siRNA group

2.5 IL-12對YTS細(xì)胞移植瘤生長及JAK2/STAT3通路的影響經(jīng)細(xì)胞實驗明確IL-12通過JAK2/STAT3通路調(diào)節(jié)YTS細(xì)胞的細(xì)胞活力、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡后，本實驗通過YTS細(xì)胞移植瘤驗證了IL-12的抗NK/T細(xì)胞淋巴瘤活性。在建立YTS細(xì)胞移植瘤小鼠模型后給予IL-12干預(yù)，移植瘤質(zhì)量明顯減輕(P<0.05，F(xiàn)ig 5A)，移植瘤中p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)明顯減少(P<0.05，F(xiàn)ig 5B)。

Fig 4 Effect of JAK2 expressed plasmid on IL-12 regulating viability, cell cycle, apoptosis of YTS

A: Transfection of JAK2 expressed plasmid attenuated the effect of IL-12 on p-JAK2, p-STAT3 expression in YTS cells; B: Transfection of JAK2 expressed plasmid attenuated the effect of IL-12 on viability of YTS cells; C: Transfection of JAK2 expressed plasmid attenuated the effect of IL-12 on cell cycle of YTS cells; D: Transfection of JAK2 expressed plasmid attenuated the effect of IL-12 on apoptosis of YTS cells.**P<0.01vsblank plasmid group,##P<0.01vs20 μg·L-1IL-12+blank plasmid group.

Fig 5 Effect of IL-12 on weight and JAK2/STAT3 of xenotransplanted

A: IL-12 decreased the weight of xenotransplanted tumor. B: IL-12 inhibited the expression of p-JAK2, p-STAT3 in xenotransplanted tumor.**P<0.01vscontrol group

3 討論

NK/T細(xì)胞淋巴瘤是我國常見的非霍奇金淋巴瘤類型，近年來的發(fā)病率呈升高趨勢且對傳統(tǒng)CHOP化療方案不敏感，臨床治療效果不佳、預(yù)后差[10-11]。近年來，免疫活性細(xì)胞因子在惡性腫瘤治療中的作用受到了越來越多的關(guān)注，包括IL-12在內(nèi)的多種細(xì)胞因子不僅能夠通過免疫調(diào)節(jié)作用來增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答、發(fā)揮抗腫瘤作用，還能直接作用于腫瘤細(xì)胞并影響凋亡、增殖、遷移、侵襲等惡性生物學(xué)行為，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。在本實驗中，IL-12被用于NK-T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株YTS的干預(yù)，0.625、1.25的IL-12干預(yù)后，YTS細(xì)胞的活力無顯著變化；2.5、5.0、10.0、20.0 μg·L-1的IL-12干預(yù)后，YTS細(xì)胞的活力明顯降低且隨著IL-12濃度的增加，細(xì)胞活力的下降更加明顯，說明IL-12能夠在一定范圍內(nèi)以濃度依賴性的方式降低YTS細(xì)胞的細(xì)胞活力、具有抗NK-T細(xì)胞淋巴瘤的作用。

為了明確IL-12影響NK-T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞活力的可能機(jī)制，本實驗進(jìn)一步對IL-12干預(yù)后的細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)行為進(jìn)行了分析。細(xì)胞周期失控會使細(xì)胞大量進(jìn)入有絲分裂階段、細(xì)胞凋亡受阻則會影響異常分裂細(xì)胞的清除，最終引起細(xì)胞過度增殖、表現(xiàn)為細(xì)胞活力增加；本實驗的分析顯示，5.0、10.0、20.0 μg·L-1的IL-12干預(yù)能夠誘導(dǎo)YTS細(xì)胞發(fā)生凋亡并使細(xì)胞周期大量停滯于G0/G1期且IL-12濃度越大，誘導(dǎo)凋亡及細(xì)胞周期停滯的效應(yīng)越顯著，說明誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞凋亡是IL-12發(fā)揮抗NK-T細(xì)胞淋巴瘤作用的可能機(jī)制。

JAK2/STAT3通路是參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控的信號通路，生長因子是該信號通路重要的上游激活分子，刺激JAK2發(fā)生磷酸化后p-JAK2能夠引起STAT3發(fā)生磷酸化，p-STAT3能夠形成二聚體并進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而調(diào)節(jié)c-myc、CyclinD1、Bcl-2等基因的表達(dá)并起到加速細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲[12]。已有研究報道，淋巴瘤組織中JAK2/STAT3通路呈過度活化的狀態(tài)，p-JAK2及p-STAT3均呈顯著高表達(dá)的狀態(tài)[13-14]；而使用JAK2/STAT3通路抑制劑AG490處理淋巴瘤細(xì)胞后，細(xì)胞周期及細(xì)胞遷移、侵襲均受到抑制，細(xì)胞凋亡則明顯增強(qiáng)[15]。本實驗在IL-12處理YTS細(xì)胞后觀察到：IL-12能夠以濃度依賴性的方式降低細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)，說明IL-12對YTS細(xì)胞中JAK2/STAT3通路的活化具有抑制作用。

在此基礎(chǔ)上，為了明確IL-12的抗NK-T細(xì)胞淋巴瘤作用是否與抑制JAK2/STAT3通路的激活有關(guān)，本實驗首先通過轉(zhuǎn)染JAK2 siRNA的方式抑制JAK2的表達(dá)，在轉(zhuǎn)染JAK2 siRNA后，細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)均減少，說明轉(zhuǎn)染JAK2 siRNA能夠抑制JAK2/STAT3通路的激活；在抑制JAK2/STAT3通路的激活后，細(xì)胞活力、細(xì)胞周期均受到抑制，而細(xì)胞凋亡明顯增強(qiáng)，說明JAK2/STAT3直接參與YTS細(xì)胞的細(xì)胞活力、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的調(diào)控。而后，通過轉(zhuǎn)染JAK2表達(dá)質(zhì)粒的方式增加JAK2的表達(dá)，在20 μg·L-1IL-12干預(yù)的同時轉(zhuǎn)染JAK2表達(dá)質(zhì)粒能夠使IL-12減少p-JAK2、p-STAT3表達(dá)的作用發(fā)生逆轉(zhuǎn)，同時也能使IL-12調(diào)節(jié)細(xì)胞活力、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的作用也發(fā)生逆轉(zhuǎn)。由此證實IL-12的抗NK-T細(xì)胞淋巴瘤作用與抑制JAK2/STAT3通路有關(guān)。

最后，本實驗還通過移植瘤動物實驗來驗證IL-12的NK-T細(xì)胞淋巴瘤作用，通過皮下注射YTS細(xì)胞的方式建立移植瘤小鼠模型，給予IL-12干預(yù)后觀察到移植瘤的質(zhì)量及移植瘤中p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)均明顯下降，這與IL-12在細(xì)胞實驗中通過JAK2/STAT3通路抑制細(xì)胞活力、細(xì)胞周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用吻合，進(jìn)一步證實IL-12具有抗NK-T細(xì)胞淋巴瘤作用且該作用與抑制JAK2/STAT3通路有關(guān)。

綜上所述，本實驗報道了IL-12的抗NK-T細(xì)胞淋巴瘤的作用，IL-12能夠以劑量依賴性的方式降低細(xì)胞活力、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡，抑制JAK2/STAT3可能是IL-12發(fā)揮抗NK-T細(xì)胞淋巴瘤的分子機(jī)制，未來IL-12有望成為治療抗NK-T細(xì)胞淋巴瘤的新藥物。