王 倩，饒江燕，王鈺淳，向菲，徐 露，田曉翠，董志

(1.重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2. 重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶 400016；3.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，重慶 401331)

腦卒中的發(fā)病率和死亡率居世界第二位，在中國(guó)每年有超過(guò)200萬(wàn)的新病例，是致殘率最高的疾病[1-2]。缺血性腦卒中的常見原因是頸內(nèi)或顱內(nèi)血管阻塞，大腦血液供應(yīng)不足，導(dǎo)致急性缺糖缺氧，引起嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙[3]。中風(fēng)不僅會(huì)導(dǎo)致灰質(zhì)損傷，還會(huì)引起深層的白質(zhì)損傷，大腦白質(zhì)主要由深穿支動(dòng)脈供血,很容易發(fā)生缺血性損傷，常常比灰質(zhì)受到更嚴(yán)重的損傷，這是導(dǎo)致腦卒中發(fā)生率升高和神經(jīng)功能不良的危險(xiǎn)因素[4]。迄今為止，組織型纖溶酶原激活物(tPA)是FDA批準(zhǔn)用于缺血性中風(fēng)的有效的治療劑。 然而，其嚴(yán)重的不良反應(yīng)和有限的治療時(shí)間窗，使其僅適用于所有中風(fēng)患者的4%～7%[5]。β-石竹烯(β-caryophyllene，BCP)，是一種雙環(huán)倍半萜型化合物，研究表明，BCP通過(guò)調(diào)節(jié)多種途徑，發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗凋亡和保護(hù)血腦屏障，它對(duì)腦缺血具有神經(jīng)保護(hù)作用[6-7]。雖然BCP目前在腦缺血/再灌注(cerebral ischemia-reperfusion，CIR)損傷模型中有較多的研究，但其作用的具體分子機(jī)制還不十分清楚，關(guān)于CIR白質(zhì)損傷(white matter injury，WMI)的研究也很少，本實(shí)驗(yàn)采用線栓法建立小鼠CIR損傷模型，給予BCP預(yù)處理，觀察BCP對(duì)CIR損傷后小鼠白質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品、試劑β-石竹烯(純度>80%)，(W225207)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)，(T8877) 購(gòu)自Sigma公司；mbp(10458-1-AP)、NF(60189-1-lg)、Bcl-2(12789-1-AP)、Bax(50599-2-lg)和caspase-3 (19677-1-AP) 等抗體均購(gòu)自Proteintech公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，成像儀(BIO-RAD)，正置熒光顯微鏡(Nikon)，高速低溫離心機(jī)(Thermo公司)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SPF級(jí)♂C57BL/6小鼠75只，體質(zhì)量為(20±2)g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào): SCXK 渝 2018-0003)，將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Control)、模型組(CIR)、BCP治療組(36、72、144 mg·kg-1)，BCP用10%蓖麻油和生理鹽水配制，以0.01 mL·g-1連續(xù)灌胃給藥d 1～5，Control組和CIR組給相同溶劑。

1.3.2建立小鼠腦缺血/再灌注模型 采用線栓法制作小鼠大腦 MCAO模型。通過(guò)腹腔注射4%的戊巴比妥鈉將小鼠麻醉，在手術(shù)臺(tái)上以仰臥位固定，沿頸部正中切開皮膚，找到右頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)、頸外動(dòng)脈(ECA)分支，并結(jié)扎ECA、CCA，用動(dòng)脈夾暫時(shí)阻斷ICA血流，在CCA剪一切口，從切口插入直徑為(18.5±0.5) mm線栓至ICA，感到阻力時(shí)停止，固定線栓,缺血1 h后，將線栓拔出使血流恢復(fù)，縫合傷口，再灌注24 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 再灌注24 h后，使用Longa等5分制評(píng)分對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。

1.3.4腦梗死體積測(cè)定 再灌注24 h后，將小鼠麻醉取腦，于-20 ℃放置30 min，作2 mm厚度的連續(xù)切片，于2%的TTC染液中，37 ℃水浴避光染色15 min，反面繼續(xù)染色15 min，4%多聚甲醛固定過(guò)夜，拍照。運(yùn)用Image J軟件分析腦小鼠腦梗死體積。

1.3.5腦含水量測(cè)定 再灌注24 h后，取出受傷側(cè)腦組織稱量其濕重后，放入120 ℃的烘箱內(nèi)干燥48 h至恒重，即為干重。腦水含量(BWC) =(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.6Western blot法檢測(cè)mbp、NF、Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白的表達(dá) 再灌注24 h，小鼠麻醉以取腦，分離受損側(cè)白質(zhì)，蛋白裂解液提取蛋白(RIPA-PMSF-磷酸酶抑制劑=100 ∶1 ∶2)，電泳分離，切膠，轉(zhuǎn)膜，5%的胎牛血清蛋白(BSA)封閉4 h，然后加入相應(yīng)的一抗，抗體稀釋比例均為1 ∶1 000～2 000，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，TBST洗膜(3×5 min)，再分別二抗孵育40 min，三抗孵育30 min，洗膜后，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液(ECL)顯影成像。應(yīng)用Image Lab軟件進(jìn)行圖像分析，β-actin作為內(nèi)參。

1.3.7HE染色 再灌注24 h后，小鼠麻醉后仰臥固定，先用200 mL PBS心臟灌注15 min，然后用4%多聚甲醛(約60 mL)灌注固定至小鼠全身僵硬，斷頭取腦，繼續(xù)在4%多聚甲醛中固定過(guò)夜，石蠟包埋，切片(厚5 μm)。按照HE染色試劑盒說(shuō)明書染色，于200倍視野下觀察胼胝體髓鞘的病理改變情況。

1.3.8透射電鏡 再灌注24 h后，麻醉取腦，在胼胝體區(qū)取1 mm3大小組織塊，2.5%的戊二醛4℃固定，于重慶醫(yī)科大學(xué)生科院電鏡室進(jìn)行后面步驟，并采集圖片。

1.3.9LFB染色 再灌注24 h后，按1.3.7項(xiàng)下操作進(jìn)行灌注、外固定，用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片(5 μm)，根據(jù)LFB染色試劑盒說(shuō)明書染色，計(jì)算髓鞘染色光密度值(OD)。

2 結(jié)果

2.1 BCP降低CIR小鼠腦梗死體積，減輕神經(jīng)功能缺損和腦含水量與正常對(duì)照組相比，缺血1 h，再灌注24 h后，小鼠缺血側(cè)腦組織出現(xiàn)大面積梗死，肢體有明顯的偏癱，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分升高，腦組織嚴(yán)重水腫；與模型組相比，BCP組可減少小鼠腦梗死體積，降低神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，減輕腦組織水腫(Fig 1A、B、C、D )。結(jié)果表明，BCP能夠減輕小鼠缺血/再灌注后損傷，其中中等劑量(72 mg·kg-1)效果最好，呈現(xiàn)出劑量依賴性保護(hù)作用。

Fig 1 Effects of BCP on cerebral infarction volume, neurobehavioral and cerebral edema in CIR mice

2.2 HE染色觀察CIR后腦白質(zhì)的病理學(xué)改變與正常對(duì)照相比，模型組小鼠的腦白質(zhì)出現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變：肉眼可見明顯的腦水腫，鏡下可見胼胝體白質(zhì)疏松，纖維排列疏松凌亂，有空泡樣改變。而BCP組CIR小鼠腦白質(zhì)的病理學(xué)改變較輕，神經(jīng)纖維排列緊密，胼胝體空泡面積明顯較少(Fig 2A,2B)。

Fig 2 Effect of BCP on pathological changes of white matter in CIR mice n=5)

A: HE staining of brain sections (×200); B: The quatitative diagram of the area of vacuoles in the corpus callosum.**P<0.01vs control group;#P<0.05,##P<0.01vsCIR

2.3 透射電鏡顯示對(duì)CIR小鼠胼胝體髓鞘的影響如Fig 3所示，正常對(duì)照組中，胼胝體的髓鞘結(jié)構(gòu)致密，染色深，呈板狀排列；模型組神經(jīng)纖維出現(xiàn)脫髓鞘現(xiàn)象，髓鞘著色明顯變淺，厚度變薄，髓鞘板層疏松、剝脫，髓鞘板層斷裂為小碎片或空泡，軸索內(nèi)細(xì)胞器腫脹。給予BCP治療后，能夠明顯減輕上述髓鞘的退行性改變。

Fig 3 Effect of BCP on ultrastructure of corpus callosum myelin sheath in CIR mice(8000×100 kV) Black arrows showed damaged corpus callosum

2.4 LFB染色觀察CIR小鼠腦白質(zhì)的髓鞘損傷正常對(duì)照組中，小鼠胼胝體LFB著色較深，髓鞘排列整齊致密，無(wú)水腫、分層。模型組LFB著色較淺，髓鞘排列疏松、有部分崩解，呈空泡狀。經(jīng)BCP治療之后，髓鞘損傷減輕，LFB染色加深，LFB染色的光密度值較模型組升高(Fig 4A,4B)。

2.5 BCP對(duì)CIR小鼠缺血側(cè)腦白質(zhì)中mbp、NF及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western blot 結(jié)果顯示：CIR 后，小鼠腦白質(zhì)中mbp、NF和Bcl-2 蛋白表達(dá)明顯減少，BCP治療后，可明顯提高mbp、NF和Bcl-2 蛋白的表達(dá)水平。而CIR后，Bax和caspase-3表達(dá)增多，BCP組則減少其在白質(zhì)中的表達(dá)，其中72 mg·kg-1劑量組變化最明顯(Fig 5)。

3 討論

灰質(zhì)(gray matter，GM)和白質(zhì)(white matter，WM)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的兩個(gè)組成部分，大約各占人類大腦的一半[8]，WM由密集的有髓鞘和無(wú)髓鞘軸索束組成，這些軸索束來(lái)自中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各種投射神經(jīng)元[9]。研究表明，WMI能夠引發(fā)傳導(dǎo)束變性，引起運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)等神經(jīng)活動(dòng)的聯(lián)絡(luò)中斷而導(dǎo)致神經(jīng)功能的障礙[10-11]。胼胝體使大腦的兩個(gè)半球能夠快速交流，但它也是皮質(zhì)下白質(zhì)卒中或血管性癡呆的主要損傷部位[9]。本實(shí)驗(yàn)著重研究BCP對(duì)CIR小鼠胼胝體髓鞘損傷的影響作用。

Fig 4 Effect of BCP on injury of corpus callosum myelin sheath in CIR mice by LFB staining n=3)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsCIR

白質(zhì)的主要組成細(xì)胞是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其中少突膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendrocyte，OLG)是形成髓鞘的主要成分，成熟的OLG是合成髓磷脂構(gòu)成髓鞘的主要成分，它的突起包繞軸突形成髓鞘[12]。髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，mbp)，由成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞分泌，是髓鞘相關(guān)性蛋白的主要成分，約占30%，對(duì)髓鞘的致密性起作用，集中分布在有髓纖維，是成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞功能活動(dòng)的標(biāo)記物[13]。在CIR發(fā)生時(shí)，OLG受損傷可導(dǎo)致mbp甲基化障礙，引起髓鞘整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性下降，髓鞘結(jié)構(gòu)的致密性受到損傷進(jìn)而導(dǎo)致髓鞘脫失，使神經(jīng)軸突的營(yíng)養(yǎng)及保護(hù)減弱甚至消失，進(jìn)一步引發(fā)了軸索變性[14]。本研究選擇mbp作為髓鞘損傷的標(biāo)志，Western blot 結(jié)果顯示，CIR后mbp的表達(dá)明顯減少，說(shuō)明有腦白質(zhì)髓鞘損傷，而給予BCP治療后，mbp的表達(dá)上升，結(jié)果表明BCP對(duì)CIR后小鼠白質(zhì)損傷具有保護(hù)作用。

Fig 5 Effect of BCP on expression of mbp, NF and caspase-3apoptosis-related proteins in CIR mice n=5)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsCIR

此外，CIR后小鼠白質(zhì)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯減少，促凋亡蛋白Bax、caspase-3表達(dá)升高，而BCP則促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，降低Bax、caspase-3表達(dá)，提示BCP對(duì)腦白質(zhì)的保護(hù)作用可能與Bax/Bcl-2凋亡機(jī)制有關(guān)，但具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的探討。本實(shí)驗(yàn)BCP共設(shè)置了3個(gè)濃度梯度，分別為36、72、144 mg·kg-1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BCP 72 mg·kg-1為最佳劑量組，36 mg·kg-1與144 mg·kg-1劑量效果不明確，總體上36 mg·kg-1較144 mg·kg-1效果好，可能原因是144 mg·kg-1用藥劑量過(guò)大，配藥所用溶劑選用的是蓖麻油，會(huì)對(duì)小鼠胃腸道產(chǎn)生刺激，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中體重減輕，對(duì)缺血/再灌損傷的耐受下降。

綜上所述，BCP能夠改善CIR小鼠腦白質(zhì)上述病理學(xué)變化，對(duì)其起到保護(hù)作用，可能與抑制Bax/Bcl-2凋亡通路有關(guān)。盡管缺血性白質(zhì)疾病具有較高發(fā)病率和重要臨床意義，但相對(duì)較少的努力投入到病理機(jī)制或?qū)ふ胰毖园踪|(zhì)疾病的治療靶點(diǎn)的研究上[15]。因此，有必要進(jìn)一步探討B(tài)CP對(duì)CIR小鼠腦白質(zhì)的作用機(jī)制，對(duì)治療腦缺血/再灌注導(dǎo)致的白質(zhì)損傷具有重要意義。