高鳳嬌，楊 琳，張嘉明，魏 明，賀秋蘭，鄒學農(nóng)，孫來保

(1. 中山大學附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510080；2. 廣州市番禺中心醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 511400；3. 中山大學附屬第六醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510655；4. 中山大學附屬第一醫(yī)院脊柱外科，廣東 廣州 510080；5. 廣東省骨科學重點實驗室，廣東 廣州 510080)

目前，腰椎間盤突出癥是導致慢性腰腿痛最常見的原因之一。據(jù)資料表明，約2%～3%的人口長期存在慢性腰腿痛現(xiàn)象，且腰腿痛是導致全球各地區(qū)勞動力喪失的首要原因[1]。臨床上一部分腰椎間盤突出癥的患者，腰椎MR檢查結(jié)果顯示椎間盤無或僅僅少量突出，影像學上無明顯的神經(jīng)壓迫征象，但患者的腰腿痛癥狀卻非常明顯，那么我們考慮這部分腰椎間盤突出癥患者的腰腿疼痛主要是由于腰椎間盤突出的髓核組織引發(fā)的神經(jīng)根炎癥，有效控制炎癥反應(yīng)可以顯著降低神經(jīng)根性痛的發(fā)病率和疼痛程度[2]。但對于這部分患者目前具體的神經(jīng)根疼痛機制不完全清楚且有效控制炎癥的方法尚不完善。

CXCL1是中性粒細胞趨化因子，通過激活相應(yīng)受體CXCR2并與之結(jié)合后產(chǎn)生促炎效應(yīng)。近年來研究[3-5]表明，CXCL1/CXCR2在骨癌痛、化療藥物致疼痛及坐骨神經(jīng)損傷致慢性疼痛的發(fā)生發(fā)展中均起到重要作用，但在腰椎間盤突出致慢性腰腿痛的發(fā)生過程中研究較少且機制不清楚。蛇床子素(osthole，Ost)是一種從中藥蛇床子中提取的單體，研究表明其有良好的抗炎鎮(zhèn)痛作用，課題組前期研究也表明Ost能有效緩解髓核致炎大鼠的神經(jīng)根炎性疼痛[6,7]，但目前Ost對大鼠髓核源性神經(jīng)根痛的抗炎鎮(zhèn)痛作用機制尚不完全明確。故本實驗擬采用自體髓核致神經(jīng)根痛大鼠模型，探索CXCL1/CXCR2在大鼠神經(jīng)根痛的發(fā)生發(fā)展中的作用機制，同時闡明Ost治療髓核源性神經(jīng)根痛的機制，及為臨床上非手術(shù)治療的腰椎間盤突出癥患者開發(fā)更有效的抗炎鎮(zhèn)痛藥物提供實驗理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級SD大鼠,♂，124只，體質(zhì)量(200～250)g，許可證號:SCXK(粵)2016-0029。大鼠飼養(yǎng)室溫度(23±2)℃、濕度(55±5)% 、噪音<85 dB，提供12 h/12 h白天和黑夜循環(huán)照明，本實驗所有動物操作均嚴格按照中山大學動物保護和使用規(guī)定。

1.2 試劑及儀器Ost(批號:S2337，Selleckchem，美國)；10%二甲亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO，Sigma，美國)；兔抗大鼠CXCL1一抗(AF5403，Affinity)；兔抗大鼠CXCR2一抗(ab14935，abcam，美國)；兔抗大鼠GAPDH一抗(AF7021，Affinity)；山羊抗兔二抗(ab6721，abcam，美國)；CXCL1中和抗體(AF-515，R&D Systems)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR036A,TaKaRa公司)；PCR擴增試劑盒(RR820A,TaKaRa公司)；聚乙烯管PE導管(OD：0.5 mm，ID：0.25 mm，寧波安來軟件科技有限公司)；Von Frey纖毛儀( Stoelting公司，美國)；醫(yī)用顯微手術(shù)電鉆(XSZ-G-1型，上海光電技術(shù)有限公司)。

1.3 動物模型建立、分組及處理

1.3.1動物模型建立 ① 髓核致炎組:用2%戊巴比妥麻醉大鼠(40～50 mg·kg-1，ip.)后，將其俯臥位固定于操作臺上。大鼠備皮后消毒鋪巾，于兩髂嵴最高點連線中點做縱向3 cm左右切口，分離背部肌肉后，用醫(yī)用顯微手術(shù)電鉆在左L5半椎板上鉆孔，輕柔地將大鼠左側(cè)L5背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)暴露，注意勿損傷神經(jīng)，再從尾骨椎體上摘取約0.4 mg的髓核通過L5椎板孔放置于左L5背根神經(jīng)根上(Fig 1)，從L5椎板鉆孔處將PE-10導管向頭側(cè)硬膜外腔輕柔置入約4 mm，并將其固定于同側(cè)肌肉組織，另一端經(jīng)皮下隧道從頸后引出，回抽無血和腦脊液流出，止血充分后逐層縫合傷口。②假手術(shù)組:取出大鼠尾部自體髓核，但不將其置于L5被根神經(jīng)節(jié)上，其余手術(shù)操作同髓核致炎組。③空白組:不作任何手術(shù)處理。

1.3.2分組及處理 第一部分：將60只♂ SPF級大鼠隨機分為3組: 髓核致炎組(NP，n=36)、假手術(shù)組(Sham，n=12)、空白組(Blank，n=12)。用up-dwon方法檢測大鼠術(shù)前1 d，術(shù)后3、7、14、21、28 d的50%機械縮足閾值(50% mechanical withdrawal threshold，50% MWT)。Sham組于術(shù)后7 d，NP組于術(shù)后3、7、14、21、28 d每個時間點均取6只大鼠的L5節(jié)段脊髓背角。用q-PCR方法檢測脊髓背角CXCL1 mRNA、CXCR2 mRNA和TNF-α mRNA的相對含量；用Western blot方法檢測脊髓背角CXCL1和CXCR2蛋白相對濃度。第二部分：將64只♂ SPF級髓核致炎后大鼠隨機均分為4組(n=16): NP+NS組，于術(shù)后d 3經(jīng)硬膜外腔給予生理鹽水50 μL；NP+DMSO組，于術(shù)后d 3經(jīng)硬膜外腔給予10% DMSO 50 μL；NP+Ost組,于術(shù)后d 3經(jīng)硬膜外腔給予82 mmol·L-1的Ost 50 μL，即每只大鼠1 mg Ost，溶于10% DMSO；NP+AF-515組，于術(shù)后d 3給予AF-515 8 μg,溶于10% DMSO。所有大鼠術(shù)前、術(shù)后、給藥后各時間點均進行疼痛行為學指標50% MWT的測定，于術(shù)后7 d取材，通過Western blot方法檢測脊髓背角CXCL1和CXCR2的相對蛋白濃度。

Fig 1 The schematic diagram of nucleus pulposus (NP)-evoked pain model of rat

A： Represents the lumbar vertebral processing schematic map; B：Represents the drilling treatment of the L5 lamina in rats,and exposing the L5 dorsal root ganglion— “↑”; C： Represents the removal of about 0.4 mg of nucleus pulposus from the caudal vertebra of rats.

1.4 行為學測試用改良后up-down方法檢測大鼠50%MWT。疼痛行為學測試時間于9 ∶00～16 ∶00進行，測試前所有大鼠均在試驗箱中適應(yīng)30 min，安靜后以不同折力von Frey纖毛刺激大鼠左足足底，避開肉墊使之稍成S形，持續(xù)6 s～8 s。大鼠后肢迅速畏縮、撤回，認為是陽性反應(yīng)。從1.4 g開始，每個強度反復刺激5次，將出現(xiàn)3次以上陽性反應(yīng)的最小von Frey纖維強度定為大鼠的50%MWT，兩次刺激之間至少間隔約15 s。按以上的流程重復測量3次，取均值。

1.5 q-PCR檢測脊髓背角CXCL1 mRNA、CXCR2 mRNA及TNF-α mRNA的表達水平2%戊巴比妥(60～80 mg·kg-1，ip)深麻醉大鼠后在冰面上迅速取出L5節(jié)段脊髓背角組織，將組織研磨成粉末狀后放進勻漿器中，按TRIzol抽提法提取脊髓背角總RNA，再檢測RNA濃度和純度。取適量RNA為模板在逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR036A，TaKaRa公司)及相應(yīng)條件下得到cDNA。采用Primer5.0設(shè)計基因特異性引物，CXCL1引物序列：5′-GCAGACAGTGGCAGGGATTC-3′(上游),5′-CGACCATTCTTGAGTGTGGCTAT-3′(下游)；CXCR2引物序列：5′-GTTCTTTGCCCTGACCTTGCC-3′(上游)，5′-TGTACTTGTGGCGTGGACGAT-3′(下游)；TNF-α引物序列：5′-GCCACCACGCTCTTCTGTCTA-3′(上游)，5′-CGCTTGGTGGTTTGCTACGA-3′(下游)； GAPDH引物序列：5′-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3′(上游),5′-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3′(下游)。根據(jù)PCR擴增試劑盒(RR820A,TaKaRa公司)反應(yīng)體系的相應(yīng)條件進行預變性、變性、退火、延伸，計算每個樣本的循環(huán)閾值(Ct值)，運用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀配套的Bio-Rad CFX Manager Software1.6 數(shù)據(jù)分析軟件進行分析，采用2-ΔΔCt法來計算CXCL1 mRNA、CXCR2 mRNA和TNF-α mRNA的相對濃度。

1.6 Western blot檢測脊髓背角CXCL1、CXCR2的蛋白表達水平所有大鼠在相應(yīng)時間點于冰上快速取出L5節(jié)段脊髓背角組織，將組織用顯微剪剪成小碎片，加入含有蛋白酶抑制劑(78439，Thermo Fisher)的組織裂解液(78510，Thermo Fisher)，然后依次進行超聲組織勻漿、水浴、及離心后取上清。根據(jù)目標蛋白分子量的大小選用10%或12%的SDS-PAGE凝膠進行電泳，Bio-Rad半干轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜后用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別與CXCL1一抗(1 ∶1 000)，CXCR2一抗(1 ∶1 000)，GAPDH一抗(1 ∶1 000)置于4 ℃冰箱孵育過夜，然后與山羊抗兔二抗(1 ∶500)室溫下孵育2 h。將PVDF膜與ECL試劑反應(yīng)后即刻顯影，用Image J 6.0軟件分析PVDF膜條帶的灰度值。實驗重復3次，將各樣品中CXCL1和CXCR2灰度值分別與相應(yīng)內(nèi)參GAPDH灰度值相除作為相應(yīng)蛋白的相對含量。

2 結(jié)果

2.1 模型建立前后大鼠機械痛閾值的變化各組大鼠術(shù)前的50% MWT差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),Sham組50% MWT在術(shù)后d 3降低(P<0.05)，然后逐漸恢復至術(shù)前水平(P>0.05)；NP組術(shù)后各時間點50% MWT較術(shù)前明顯降低(P<0.05)；與Sham組相比，NP組術(shù)后各觀測時間點50% MWT明顯降低(P<0.05)。見Fig 2。

Fig 2 Variation of 50%MWT before and after surgery )

*P<0.05vspreoperative 50% MWT of NP group ;#P<0.05vssham group;△P<0.05vspreoperative 50% MWT of sham group

2.2 建模后不同時間點CXCL1 mRNA、CXCR2 mRNA 和TNF-α mRNA的表達情況與Sham組比較，NP組術(shù)后3、7、14、21、28 d各時間點NP組大鼠的脊髓背角CXCL1 mRNA，CXCR2 mRNA和TNF-α mRNA的表達量均明顯增加(P<0.05)。NP組TNF-α mRNA在術(shù)后d 3明顯升高(P<0.05)持續(xù)至術(shù)后14 d(P<0.05),之后稍有下降至術(shù)后28 d(P<0.05)；NP組CXCL1 mRNA和CXCR2 mRNA在術(shù)后3 d開始升高(P<0.05)，于術(shù)后14 d達高峰(P<0.05)。見Fig 3。

Fig 3 Expression of CXCL1 mRNA,CXCR2 mRNA and TNF-α mRNA in different groups of rats at different time

*P<0.05,#P<0.05,△P<0.05vssham group

2.3 建模后不同時間點CXCL1和CXCR2蛋白的相對表達情況與Sham組比較，NP組術(shù)后3、7、14、21、28 d各時間點大鼠脊髓背角CXCL1和CXCR2的蛋白相對表達量均明顯增加(P<0.01)。見Fig 4。

2.4 硬膜外腔給予髓核致炎大鼠不同藥物對機械痛的影響術(shù)前各組大鼠的50%MWT差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，各組大鼠在術(shù)后d 3均出現(xiàn)50%MWT顯著下降，與術(shù)前比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。各組髓核致炎大鼠術(shù)后d 3經(jīng)硬膜外管給予等體積的不同藥物。NP+NS組大鼠的50%MWT在硬膜外注射生理鹽水(NS)前后無明顯變化(P>0.05)；NP+DMSO組大鼠的50%MWT在硬膜外注射DMSO前后無明顯變化(P>0.05)；NP+AF-515組大鼠的50%MWT較給藥前有所提高(P<0.05)，維持至給藥后12 h(P<0.05)；NP+Ost組大鼠的50%MWT較給藥前明顯提高(P<0.01)，治療效果持續(xù)至術(shù)后d 14(P<0.01)。給藥后各時間點，NP+NS組和NP+DMSO組的50%MWT差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。NP+Ost組和NP+AF-515組的50%MWT較NP+DMSO組均明顯提高(P<0.05)，其中給藥后NP+AF-515組的50%MWT比NP+Ost組低(P<0.05)。見 Fig 5。

Fig 4 Expression of CXCL1/CXCR2 protein in different groups of rats at different time points after

A,B: Western blot results showed an increase of CXCL1 in the spinal cord after surgery on days 3,7,14,21 and 28. C,D: Western blot results showed an increase of CXCR2 in the spinal horn cord after surgery on days 3,7,14,21 and 28.**P<0.01vssham group.

2.5 髓核致炎大鼠硬膜外腔給予不同藥物后CXCL1/CXCR2蛋白的表達情況與NP+NS組(0.92±0.11)和NP+DMSO組(0.99±0.10)比較，NP+Ost組(0.49±0.07)大鼠脊髓背角中CXCL1蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)。NP+NS組和NP+DMSO組大鼠脊髓背角中CXCL1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與NP+NS組(1.02±0.05)和NP+DMSO組(1.00±0.11)比較，NP+Ost組(0.45±0.06)大鼠脊髓背角中CXCR2蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)。NP+NS組和NP+DMSO組大鼠術(shù)后d 7脊髓背角中CXCR2蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見 Fig 6。

Fig 5 Effect of epidural application of different solutions on 50%MWT of rats with nucleus pulposus-induced hyperalgesia

“↑”: administration of different drugs.**P<0.01,*P<0.05vsNP+DMSO group.

3 討論

腰椎間盤突出髓核組織的致炎特性是非壓迫性腰椎間盤突出所致根性神經(jīng)痛的重要機制之一[8]。自體髓核作為椎間盤中的“隔離抗原”，一旦椎間盤的突出后暴露被免疫系統(tǒng)識別，即可激發(fā)機體產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)，誘發(fā)炎癥，促使中性粒細胞、單核巨噬細胞等炎性細胞募集、增殖，釋放各種溶酶、炎癥細胞因子，引起神經(jīng)根腫脹、空泡變性。課題組前期的動物模型研究證實，突出的髓核組織接觸神經(jīng)根后大鼠產(chǎn)生明顯的痛覺過敏[9,10]。同時，腰椎間盤突出的髓核引發(fā)的非菌性炎癥與患者的腰腿痛臨床表現(xiàn)也有密切聯(lián)系[8]。研究表明，自體的髓核組織能夠引起硬脊膜和/或神經(jīng)根的化學性炎癥，突出的椎間盤組織含有生化和/或免疫刺激物，可引起機體炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)激反應(yīng)[11]。有效控制炎癥能夠明顯降低神經(jīng)根性痛的發(fā)病率和炎癥反應(yīng)的程度，這已成為國內(nèi)外椎間盤突出癥致腰腿痛研究的重要方向[12]。

趨化因子是一種小的趨化細胞因子，可以控制白細胞和外周免疫和/或膠質(zhì)細胞的遷移行為，同時趨化因子參與病理性疼痛的發(fā)生與發(fā)展，如炎癥和神經(jīng)性疼痛。膠質(zhì)細胞和神經(jīng)細胞可以激活趨化因子來影響外周致敏和神經(jīng)可塑性，從而調(diào)節(jié)疼痛過程。CXCL1是C-X-C趨化因子家族成員，其氨基末端含有Glu-Leu-Arg序列,是一個中性粒細胞的化學引誘物[13]。CXCL1主要由巨噬細胞和中性粒細胞產(chǎn)生，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，CXCL1主要表達于星形膠質(zhì)細胞。趨化因子CXCL1是CXCR2受體的有效激動劑[14]，后者屬于G蛋白偶聯(lián)受體-即7次跨膜受體，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要表達于神經(jīng)元細胞。CXCL1蛋白的表達主要受NF-κB的調(diào)控，NF-κB是參與炎癥過程相關(guān)基因表達的重要轉(zhuǎn)錄因子[3]。在長春新堿致神經(jīng)病理性疼痛的研究[4]中，通過靶向抑制CXCL1/CXCR2通路，可以明顯緩解小鼠的痛覺過敏。另外，CXCL1-CXCR2通路的活化介導小鼠骨癌痛的發(fā)生發(fā)展[3,15]。坐骨神經(jīng)損傷的研究中，星形膠質(zhì)細胞中CXCL1的激活在痛覺過敏的發(fā)生發(fā)展過程中也起到重要作用[5]。本實驗采用大鼠自體髓核致炎模型，髓核致炎組機械痛閾值在術(shù)后d 3開始降低，到d 7降至最低，可持續(xù)至術(shù)后d 28，且術(shù)后炎癥因子TNF-α mRNA的表達明顯升高，表明模型建立成功。通過取L5節(jié)段脊髓背角做q-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，髓核致炎組大鼠脊髓背角CXCL1 mRNA、CXCR2 mRNA和TNF-α mRNA的表達較Sham組均明顯增加,Western blot實驗檢測到脊髓背角CXCL1和CXCR2的蛋白相對表達量也增加，說明髓核致炎模型大鼠的脊髓背角中存在CXCL1/CXCR2的活化增加。

Fig 6 Expression of CXCL1/CXCR2 in different groups of rats atdifferent time points after intrathecal injection of different solutions

**P<0.01vsNP+DMSO group.

為了進一步驗證CXCL1/CXCR2是否參與髓核致炎大鼠神經(jīng)根痛的發(fā)生發(fā)展，在模型建立后d 3經(jīng)硬膜外導管給予CXCL1的中和抗體(AF-515)，可觀察到大鼠的機械痛閾值升高，但持續(xù)時間僅12 h左右，其中在給藥后7 h出現(xiàn)較明顯的痛閾值增高。CXCL1中和抗體經(jīng)硬膜外腔單次給藥可中和大鼠脊髓局部CXCL1，使得CXCL1激活相應(yīng)受體CXCR2的量減少，同時與CXCR2的結(jié)合也減少，以發(fā)揮對CXCL1-CXCR2通路的阻斷效應(yīng)，這可能是本實驗中AF-515改善大鼠機械性痛敏發(fā)揮抗炎效果的主要原因。因而，我們認為CXCL1-CXCR2可能參與了髓核致炎大鼠髓核源性神經(jīng)根痛的發(fā)生發(fā)展。Ost是一種中藥單體，化學結(jié)構(gòu)為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素，具有抗炎鎮(zhèn)痛的作用。在本實驗中，術(shù)后d 3經(jīng)硬膜外導管給予Ost 1 mg，可明顯改善大鼠自體髓核誘發(fā)的機械性痛敏，且作用效果可以維持至術(shù)后d 14(給藥后d 11);在術(shù)后d 7(給藥后d 3)，NP+Ost組大鼠脊髓背角CXCL1和CXCR2蛋白均發(fā)生下調(diào)。因而，Ost能有效緩解髓核致炎大鼠的痛覺過敏，并伴有L5脊髓背角CXCL1/CXCR2蛋白表達明顯減少。本實驗的研究結(jié)果表明，抑制髓核致炎大鼠脊髓背角CXCL1/CXCR2的表達很可能是蛇床子素發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用的重要機制之一。

NF-κB作為CXCL1蛋白生成的主要轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控CXCL1的生成與活化。本研究中僅探索了Ost對CXCL1-CXCR2通路的抑制作用，而Ost是否通過影響上游的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化來調(diào)控大鼠的痛覺過敏未進行深入研究。由于CXCl1中和抗體硬膜外腔單次給藥僅能短時間內(nèi)抑制疼痛行為學，我們有理由再進一步探究CXCL1的上游調(diào)控體系，以完善Ost抗炎鎮(zhèn)痛的理論依據(jù)及探究Ost在髓核致炎大鼠中通過下調(diào)CXCL1/CXCR2表達的具體機制。

綜上，自體髓核置于L5神經(jīng)根周圍誘導產(chǎn)生神經(jīng)根炎癥和疼痛超敏反應(yīng)后，大鼠脊髓背角中CXCL1/CXCR2的表達明顯增加，給予CXCL1中和抗體(AF-515)和蛇床子素后，大鼠行為學改善并且脊髓背角CXCL1/CXCR2的表達明顯下調(diào)。本研究證實大鼠脊髓背角中的CXCL1/CXCR2在髓核導致的神經(jīng)根痛的發(fā)生發(fā)展中起到重要角色，且Ost可能通過抑制趨化因子CXCL1及其受體CXCR2的表達而緩解大鼠痛覺過敏。

(致謝：本實驗研究在廣東省廣州市中山大學第一附屬醫(yī)院骨科研究所完成，感謝各位老師和實驗室同事對本實驗的指導和幫助！)