唐曉麗，楊 依，劉 悅，方 芳

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥藥理系，北京 102488)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種與衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病。隨著人口老齡化，AD已被認(rèn)為是65歲以上老人的健康殺手。流行病學(xué)顯示，2001年全球老年癡呆癥的患者高達2 430萬人，預(yù)計到2040年增加到8 110 萬人[1]，AD則是老年癡呆癥的主要構(gòu)成因素。AD的主要病理學(xué)特征為細胞外β-淀粉樣蛋白沉積，細胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)和選擇性神經(jīng)元死亡。AD病人臨床表現(xiàn)為記憶力減退，認(rèn)知障礙以及人格改變。在AD病人的腦中均存在富含β-淀粉樣蛋白的老年斑和微管相關(guān)蛋白Tau高度磷酸化形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)，β-淀粉樣蛋白寡聚體和高度磷酸化的Tau蛋白均有神經(jīng)毒性，可能參與AD的發(fā)病機制?？茖W(xué)家們經(jīng)過不斷的探索，依然未能找到逆轉(zhuǎn)AD確有療效的藥物，主要原因是AD為一種由多因素導(dǎo)致的疾病，其確切的病理機制還未闡明。穩(wěn)定的病理模型有利于闡明AD的病因、分子機制及治療藥物評價。近年來，秀麗隱桿線蟲因神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單、遺傳信息清晰、生命周期短等優(yōu)點作為一種模型生物，在神經(jīng)退行性疾病、肌肉萎縮癥[2]、抗感染[3]等領(lǐng)域的藥物研究中得到廣泛的應(yīng)用。本文結(jié)合AD的主要病理特征，對近幾年秀麗隱桿線蟲在AD研究中的應(yīng)用作簡要總結(jié)。

1 秀麗隱桿線蟲簡介

1.1 生物學(xué)特征秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans，C.elegans)屬于動物界、線形動物門、小桿亞綱(Rhabditia)、小桿目(Rhabditidia)、小桿總科(Rhabditoidea)，它以細菌為食，在土壤中營自由生活，成蟲體長為1.0～1.5 mm，體直徑約為70.0 μm。有雌雄同體蟲和雄蟲兩種蟲體(Fig 1)，自然界中大多為雌雄同體蟲。雌雄同體蟲一生可產(chǎn)卵約300個，卵發(fā)育成成蟲后的雌雄同體蟲體細胞有959個，雄蟲有1 031個。線蟲從卵發(fā)育至成蟲大約為3 d，一生經(jīng)歷卵、幼蟲期(L1-L4期)和成蟲期3個時期。在幼蟲時期出現(xiàn)食物短缺或比較擁擠的情況時，線蟲便進入生長停滯狀態(tài)(Dauer時期)，該時期的線蟲有如特異的冀膜等獨特的形態(tài)學(xué)特征，運動減少且壽命延長[4]。

1.2 秀麗隱桿線蟲作為模式生物的優(yōu)勢首先，線蟲具有簡單的神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，只有1～2個不分叉的突起，形成或接受突觸連接，但其基本功能與哺乳動物相似，具有主要的神經(jīng)遞質(zhì)(乙酰膽堿、五羥色胺、多巴胺、谷氨酰胺等)，并且線蟲的神經(jīng)系統(tǒng)含有高等動物神經(jīng)系統(tǒng)的大多數(shù)分子成分，可利用全基因組序列提供的信息和同源克隆等方法，分離高等動物神經(jīng)系統(tǒng)基因[5]。這些都為研究神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)功能及神經(jīng)環(huán)路提供了條件。其次，線蟲身體透明，在顯微鏡下易于觀察。用不同的探針染色時在激發(fā)光下激發(fā)能產(chǎn)生相應(yīng)的熒光，便于進行定性分析，如將綠色熒光蛋白定向?qū)刖€蟲體內(nèi)可觀測某個基因表達量的變化。第三，遺傳信息清晰。線蟲基因組大小為9.7×107個堿基，大約是人類的1/30，其中基因組序列40%與人類同源，與人類疾病相關(guān)的基因同源的基因有533個，在已發(fā)現(xiàn)的信號通路中與人類同源的有12條[6]。利用線蟲基因組與人類基因的保守性，RNAi技術(shù)也被廣泛應(yīng)用，從而為觀察單個基因在線蟲中的作用研究提供可靠的條件。第四，生命周期短，后代數(shù)目多。線蟲發(fā)育至成蟲期即開始產(chǎn)卵，產(chǎn)卵周期約為3 d，在短期內(nèi)可獲得大量可用的模型線蟲。這些優(yōu)點使得線蟲作為模型生物用于研究衰老相關(guān)的各種疾病(包括AD等神經(jīng)退行性疾病)的病理機制和候選藥物篩選成為可能。

2 AD相關(guān)的秀麗隱桿線蟲模型

2.1 Aβ轉(zhuǎn)基因線蟲模型Aβ是一段由38或40個氨基酸組成的肽，由一種跨膜蛋白——淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶剪切而形成，具有自聚集的傾向。Aβ寡聚體異常沉積不但會阻止神經(jīng)遞質(zhì)從突觸前到突觸后的傳遞，從而導(dǎo)致突觸功能障礙和神經(jīng)元丟失，而且還會在AD病人的腦中異常堆積形成老年斑，對神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重的傷害。在線蟲中存在與哺乳動物APP同源的基因apl-1，其過表達對壽命呈現(xiàn)組織特異性影響。apl-1在神經(jīng)元中過表達會導(dǎo)致壽命減少，但是在皮下組織中過表達則能通過抑制異時轉(zhuǎn)錄因子LIN-14的功能，以及通過DAF-16、HSF-1和DAF-12發(fā)出信號來延長壽命[7]。線蟲中雖然存在APP同源的基因apl-1，但因缺少β-分泌酶而無法產(chǎn)生Aβ，因此轉(zhuǎn)基因線蟲AD模型主要通過轉(zhuǎn)入人源Aβ基因，使其在特定神經(jīng)元或肌肉細胞中表達，這些轉(zhuǎn)基因線蟲主要表達Aβ1-40或Aβ1-42基因，從而來模擬Aβ對AD病人造成的神經(jīng)損傷。Link等[8]在1995年首先建成第一個轉(zhuǎn)入Aβ1-42的線蟲模型CL2006，在該模型中檢測到了Aβ在線蟲體壁肌細胞中的細胞毒性，通過肌肉特異性啟動子unc-54在線蟲肌肉中漸進性地表達Aβ基因，使線蟲呈現(xiàn)漸近性癱瘓的表型。Aβ導(dǎo)致的癱瘓效應(yīng)與年齡有關(guān)且依賴胰島素信號途徑，將Aβ表達在特定神經(jīng)元如谷氨酸神經(jīng)元中，線蟲出現(xiàn)年齡依賴性的谷氨酸神經(jīng)元退化變性[9]。這些Aβ轉(zhuǎn)基因線蟲體內(nèi)的基因、蛋白分子及信號通路變化與AD病人腦內(nèi)的變化有很多相似之處，對于藥物篩選特別是有關(guān)Aβ解聚作用的藥物研究具有重要的意義。Tab 1是秀麗隱桿線蟲的Aβ 轉(zhuǎn)基因模型[10]。

Fig 1 C.elegans pattern

2.2 Tau轉(zhuǎn)基因線蟲模型Tau蛋白過度磷酸化是AD的主要發(fā)病機制之一，Tau蛋白是一種微管結(jié)合蛋白，其過度磷酸化會降低與微管之間的親和力，過度磷酸化的Tau蛋白聚集會引起神經(jīng)元纖維纏結(jié)(AD主要病理學(xué)特征之一)，最終導(dǎo)致細胞骨架的降解[11]。研究Tau蛋白的聚集、高度磷酸化及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是近年來AD研究的熱點之一。Tau轉(zhuǎn)基因線蟲模型著重于tau基因的表達變化，通過其在線蟲體內(nèi)特異性表達來模擬AD病人由Tau異常所造成的神經(jīng)損傷。在線蟲中存在一種ptl-1的基因來負(fù)責(zé)維持細胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，這種基因雖與tau基因具有直向同源性，但只在一小部分神經(jīng)元中表達，Tau轉(zhuǎn)基因線蟲模型用表達人Tau蛋白突變體的線蟲，可以避免內(nèi)源性Tau的干擾。Kraemer等[12]在線蟲中建立了Tau轉(zhuǎn)基因模型P301L和V337M，這兩種模型能夠在觸覺神經(jīng)元細胞中分別特異性地過表達人的野生型和突變型tau基因，并且都會出現(xiàn)運動不協(xié)調(diào)的表型，當(dāng)模型線蟲中的觸覺神經(jīng)元失去其功能時，由于tau基因的過表達使得神經(jīng)炎癥增強，后期微管損失加重，大部分退化神經(jīng)元在細胞體和神經(jīng)元中產(chǎn)生Tau積累。Miyasaka1等[13]利用RNAi技術(shù)開發(fā)出在泛神經(jīng)元中以不同水平表達人類Tau的轉(zhuǎn)基因線蟲，這種線蟲以Tau蛋白表達依賴的方式表現(xiàn)出行為異常，用這些模型進一步實驗發(fā)現(xiàn)，微管蛋白特異性伴侶或微管蛋白子集的敲低導(dǎo)致Tau毒性增強，即使在表達無異常行為的低表達Tau轉(zhuǎn)基因線蟲中也是如此。Tab 2是秀麗隱桿線蟲的Tau轉(zhuǎn)基因模型[14]。

2.3 Aβ和Tau雙轉(zhuǎn)基因線蟲模型Wang等[15]將轉(zhuǎn)Aβ1-42基因的線蟲CL2355和Tau轉(zhuǎn)基因線蟲BR5270通過遺傳雜交技術(shù)建立了雙轉(zhuǎn)基因的線蟲模型UM001，與單轉(zhuǎn)基因(Aβ1-42/Tau)線蟲比較，能明顯縮短線蟲壽命，與野生型線蟲N2比較，UM001后代的存活率下降以及產(chǎn)卵數(shù)目減少。五羥色胺作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)能夠調(diào)節(jié)多種生理功能，其含量及功能異常與AD等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病有關(guān)。通過遺傳雜交獲得的雙轉(zhuǎn)基因線蟲神經(jīng)系統(tǒng)功能減弱，趨化性聯(lián)想學(xué)習(xí)記憶能力降低，五羥色胺能受到損傷，同時多巴胺能信號降低，進而丟失多巴胺能神經(jīng)元。雙轉(zhuǎn)基因線蟲中的Aβ1-42影響五羥色胺能神經(jīng)功能，而Tau影響五羥色胺能和多巴胺能神經(jīng)功能。此外，在基因異常表達方面，對雙轉(zhuǎn)基因線蟲進行基因測序分析，有8個基因(ptch1、tbc1d16、wdfy3、arfgef2、ebf1、dao、grm1、p4ha2)與AD病人腦中的基因表達變化重合，這進一步表明雙轉(zhuǎn)基因線蟲模型更接近AD病人神經(jīng)病變的生物學(xué)特征，體現(xiàn)Aβ1-42和Tau呈現(xiàn)相互促進作用，加重毒性。

3 藥物通過不同途徑保護AD模型線蟲

3.1 減少Aβ轉(zhuǎn)基因線蟲體內(nèi)氧化應(yīng)激水平氧化應(yīng)激是指生物體細胞產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)的不平衡，以及生物體在面對某些內(nèi)源性或外源性刺激時抵消ROS這種不平衡的能力。Aβ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和毒性則是AD的主要危險因素，目前已研究出很多藥物以抗氧化劑的形式減少Aβ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。如紅曲素(monascin，MS)是一種來源于食用菌的次生代謝產(chǎn)物，是具有抗氧化作用的新型化合物。研究顯示，MS能使CL2006和CL4176線蟲的Aβ聚集量和癱瘓水平下降，在胡桃醌(250 μmol·L-1)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激條件下，MS增加了線蟲的存活率，減弱了線蟲內(nèi)源性ROS水平[16]。進一步用實時熒光定量PCR檢測到MS增加了CL4176線蟲中daf-16基因和抗氧化基因sod-1，sod-2，sod-3，hsp16.2的mRNA水平。在CL2006和CL4176線蟲中進行daf-16 RNAi，發(fā)現(xiàn)MS未能使癱瘓水平降低，說明MS可能依賴DAF-16而發(fā)揮降低氧化應(yīng)激和Aβ毒性的作用。

Tab 1 Aβ transgenic model of C.elegans

Tab 2 Tau transgenic model of C.elegans

三基數(shù)旱地菊水醇提取物(carqueja hydroalcoholic extract，CHE)和氧代異丙腎上腺素生物堿衍生物8-1也能增強氧化壓力抗性，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下通過不同的方式對線蟲起到保護的作用。CHE既在氧化應(yīng)激條件下通過提高野生型線蟲的存活率并降低ROS水平來改善氧化壓力抗性，而這種作用不依賴于轉(zhuǎn)錄因子(SKN-1和DAF-16)以及應(yīng)激相關(guān)的信號通路(p38, JNK和ERK)。CHE還能增加蛋白酶體活性和兩種熱休克蛋白基因hsp-16.2、hsp-4的表達，進而提高CL4176線蟲對Aβ毒性的防御能力[17]。氧代異丙腎上腺素生物堿衍生物8-1能夠延遲GMC101線蟲的麻痹表型，在H2O2誘導(dǎo)的急性氧化應(yīng)激和百草枯誘導(dǎo)的慢性氧化應(yīng)激條件下均可提高GMC101線蟲的存活率，同時還能增強GMC101線蟲中自噬起始基因bec-1的表達水平[18]。

3.2 抑制Aβ轉(zhuǎn)基因線蟲體內(nèi)Aβ聚集從而降低毒性Aβ轉(zhuǎn)基因線蟲模型的主要特征是在線蟲的特定神經(jīng)元或肌肉細胞中存在Aβ基因的漸近性表達，使線蟲表現(xiàn)出漸近性地癱瘓。一些天然產(chǎn)物和藥物成分能夠抑制CL4176、GMC101等模型線蟲中的Aβ聚集，從而來降低Aβ誘導(dǎo)的毒性損傷。有研究顯示，一種新型卟啉肽DhHP-6具有微過氧化物酶活性和細胞滲透性，能夠有效抑制Aβ聚集并降低Aβ的β-折疊率[19]。DhHP-6 100 μmol·L-1能顯著延長CL4176線蟲的壽命，降低癱瘓表型，抑制Aβ 斑塊形成從而降低Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。此外，8-羥基喹啉(8-hydroxyquinolines，8-HQ)能以1～10 μmol·L-1的親和力結(jié)合Aβ并抑制大寡聚體(>30 kDa)的形成，通過穩(wěn)定小二聚體無毒Aβ構(gòu)象異構(gòu)體來中和具有神經(jīng)毒性的Aβ寡聚體形成，用8-HQ處理也降低了GMC101線蟲體內(nèi)可溶性Aβ寡聚體的水平[20]。

3.3 維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)改善Aβ轉(zhuǎn)基因線蟲的病理變化泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)負(fù)責(zé)控制細胞內(nèi)許多關(guān)鍵過程相關(guān)蛋白質(zhì)的降解，包括細胞周期和轉(zhuǎn)錄，以及蛋白質(zhì)質(zhì)量控制。蛋白酶體是UPS的重要組成成分之一，也是細胞蛋白水解網(wǎng)絡(luò)的組成部分，通過對正常和異常蛋白的蛋白水解作用的調(diào)節(jié)來維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)[21]。基于蛋白酶體在維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)中的重要作用，科學(xué)家們從蛋白酶體出發(fā)進行了一系列的研究。

不同藥物或活性成分能通過增加蛋白酶體活化特性或以DAF-16依賴的方式等多種途徑來改善蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。研究顯示，18α-甘草次酸(18a-glycyrrhetinic acid，18α-GA)具有蛋白酶體活化特性，可作為多細胞生物體中延長壽命和抗凝聚的因子[21]。18α-GA喂養(yǎng)線蟲導(dǎo)致蛋白酶體活性增加，隨著蛋白酶體活性的升高對Aβ模型線蟲產(chǎn)生了一定的影響，如CL4176和CL2006的癱瘓率降低，CL2331和CL4176中的Aβ聚集減少等。線蟲中的skn-1基因與人類Nrf基因具有同源性，能夠維持UPS的表達和活性。當(dāng)?shù)鞍酌阁w基因表達和活性被阻斷時，SKN-1能夠發(fā)揮激活多類蛋白酶體亞基基因的作用，在一定條件下SKN-1會參與線蟲中的蛋白酶體活化[22]，18α-GA還能以SKN-1和蛋白酶體活化依賴性的方式延長線蟲的壽命。有研究表明，飲食干預(yù)可以促進健康并有助于預(yù)防AD，蜂王漿及酶處理的蜂王漿補充劑均能延緩CL2006線蟲的麻痹，發(fā)揮作用依賴于DAF-16和胰島素/胰島素樣生長因子信號通路而不需要HSF-1和SKN-1[23]。蛋白質(zhì)溶解度是蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的標(biāo)志，蜂王漿及酶處理的蜂王漿補充劑以DAF-16依賴的方式改善了蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。

3.4 對抗Tau過度磷酸化減輕Tau轉(zhuǎn)基因線蟲的病理變化能量代謝受損是AD發(fā)病進展的重要標(biāo)志，抑制能量代謝有關(guān)的線粒體酶——二氫硫辛酰胺脫氫酶(dihydrolipoamide dehydrogenase，DLD)，可導(dǎo)致Tau轉(zhuǎn)基因線蟲VH255全身葡萄糖水平升高以及Tau磷酸化增加。此過程通過RNAi技術(shù)抑制dld-1基因或直接用抑制劑2-甲氧基吲哚-2-羧酸抑制DLD酶，最終誘導(dǎo)了線蟲的高血糖和Tau磷酸化。鈣離子載體A23187可以減少由DLD的化學(xué)或遺傳抑制誘導(dǎo)的Tau磷酸化起到對線蟲的保護作用，但它不能減少由高血糖誘導(dǎo)的Tau磷酸化[24]。

Tau模型線蟲V337M表現(xiàn)出壽命縮短，運動不協(xié)調(diào)和磷酸化不溶性Tau積累的特征。Gamir-Morralla等[25]研究具有蛋白質(zhì)抗聚集性的硫磺素T(thioflavin T，Th T)和一種具有高選擇性的糖原合酶激酶-3抑制劑NP103對V337M線蟲的影響，分別從壽命和運動表型方面進行檢測。結(jié)果顯示，Th T的不同濃度10、25、50 μmol·L-1均延長了V337M線蟲的壽命，NP103濃度為100 μmol·L-1時改善了V337M線蟲的麻痹表型，但對壽命沒有顯著影響。

4 結(jié)語

AD是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，目前尚無確切的治療方法，使用一種經(jīng)濟高效的動物模型對AD的藥物研究及篩選至關(guān)重要。線蟲作為模型生物具備神經(jīng)系統(tǒng)簡單、正向遺傳、容易進行RNAi、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因體系等優(yōu)點，與大鼠、小鼠等模型相比用藥方便，飼養(yǎng)簡單，成為能夠研究AD等神經(jīng)退行性疾病的重要手段。通過不同的技術(shù)手段建立的Aβ轉(zhuǎn)基因及Tau轉(zhuǎn)基因線蟲模型較多，目前應(yīng)用Tau轉(zhuǎn)基因線蟲研究Tau蛋白的損傷機制及AD藥物的篩選與利用Aβ轉(zhuǎn)基因線蟲進行的研究相比較少，利用Tau模型線蟲還有著很大的研究空間。因此，利用線蟲進行抗AD等神經(jīng)退行性疾病藥物的毒性評價及藥物篩選具有廣闊的應(yīng)用前景。