微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一類非編碼RNA，是一種內(nèi)源性非編碼單鏈RNA 小分子（約20個(gè)bp），通過調(diào)控靶基因表達(dá)參與大多數(shù)生物學(xué)過程，其介導(dǎo)的基因調(diào)控功能為解釋多種疾病的復(fù)雜機(jī)制提供了新的證據(jù)[1]。肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），簡稱肝癌，是最常見的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤，是世界范圍內(nèi)第6 大實(shí)體惡性腫瘤，也是癌癥類疾病死亡的第4 大病因[2-4]。HCC 發(fā)病率在我國相關(guān)腫瘤疾病中排名第4，致死率排名第3[5]。根據(jù)流行病學(xué)以及相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，許多外部環(huán)境因素以及病毒性疾病和藥物的使用，導(dǎo)致了肝損傷和HCC的迅速發(fā)生，然而HCC 發(fā)生和發(fā)展的確切機(jī)制尚未完全闡明[6]。推進(jìn)HCC 與miRNAs 之間關(guān)系的深入研討，將為HCC 分子機(jī)理研究、臨床診療和預(yù)后評估提供新的思路。本文旨在強(qiáng)調(diào)miRNAs在肝癌發(fā)生發(fā)展、多重耐藥性中的作用以及作為肝癌潛在治療靶點(diǎn)的價(jià)值，并就miRNAs在HCC 中的功能、分子作用通路和應(yīng)用三方面的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、miRNAs 簡介

Lee 等[7]1993年首次對突變體的遺傳特性進(jìn)行了剖析，發(fā)現(xiàn)了一種能夠調(diào)控其晚期胚胎發(fā)育基因的新型RNA，引起了世界各國的關(guān)注和研究。miRNAs是可通過堿基互補(bǔ)配對原則靶向結(jié)合至特定蛋白編碼基因mRNA的3'端非翻譯區(qū)并介導(dǎo)其降解或阻滯翻譯，其對基因表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用，根據(jù)靶點(diǎn)的細(xì)胞功能來促進(jìn)或抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1，8]。

miRNAs的生物發(fā)生首先系由RNA 聚合酶Ⅱ介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄為初級miRNAs。初級miRNAs 經(jīng)由核糖核苷酸內(nèi)切酶Ⅲ即Drosha及其輔助因子DGCR8 一起在細(xì)胞核內(nèi)加工形成前體miRNAs[9]。這種前體miRNAs 呈發(fā)夾狀，經(jīng)由exportin-5 輸出到細(xì)胞質(zhì)，并被核酸內(nèi)切酶Dicer及其復(fù)合體切割形成雙鏈miRNAs[10]。最后，加工成熟的雙鏈miRNAs解鏈后，誘導(dǎo)鏈被整合到RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體中，進(jìn)而介導(dǎo)靶基因mRNA的降解或翻譯抑制，另一條miRNAs 則通常被降解。

miRNAs 既可以通過調(diào)控靶分子群的表達(dá)來維持其在細(xì)胞內(nèi)的功能，也可以從結(jié)合其他蛋白的細(xì)胞中釋放出來，并以自由分子形式存在。作為釋放小泡的一部分，特定的miRNAs 可以在局部保持其功能活性，或者通過血液等運(yùn)輸?shù)狡渌M織或器官[11]。miRNAs 多樣化的功能及調(diào)控作用為其成為早期HCC 診治、預(yù)后評估的重要工具和全新有效的癌癥治療靶點(diǎn)提供了可能。

二、miRNAs在肝癌中的功能

（一）miRNAs 作為癌基因的功能及作用機(jī)制

研究發(fā)現(xiàn)許多miRNAs在HCC 中發(fā)揮著癌基因的作用，這些miRNAs在HCC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平上調(diào)。miRNAs 通過信號通路調(diào)控下游靶基因、靶蛋白，從而對HCC 起到致癌基因的作用。Xiao 等[12]從研究中發(fā)現(xiàn)miR- 330-5p 通過靶向Sprouty2蛋白來激活蛋白激酶（細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶）信號通路，促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖；miRNAs 通過直接結(jié)合到靶基因的mRNA的3'端非翻譯區(qū)，從而對HCC 起到致癌基因的作用。Fu 等[13]發(fā)現(xiàn)miR-155-5p 可通過靶向結(jié)合PTEN 基因的3'端非翻譯區(qū)以調(diào)控其表達(dá)，進(jìn)而通過影響PI3K/Akt信號通路以促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，并抑制HCC細(xì)胞的凋亡；miRNAs 通過調(diào)節(jié)去磷酸化，從而對HCC 起到致癌基因的作用。Li 等[14]研究發(fā)現(xiàn)miR-552 通過阻斷Wnt 抑制因子1 介導(dǎo)的糖原合成激酶-3β去磷酸化促進(jìn)HCC的發(fā)生和發(fā)展。miR-552在HCC組織中表達(dá)上調(diào)，其過表達(dá)促進(jìn)Hep3B細(xì)胞的遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

（二）miRNAs 作為抑癌基因的功能及作用機(jī)制

研究發(fā)現(xiàn)許多miRNAs在HCC 中發(fā)揮著抑癌基因的作用，這些miRNAs在HCC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平下調(diào)。miRNAs 通過多種信號通路調(diào)控靶基因或靶蛋白，對HCC 起到抑癌基因的作用。Wu 等[15]發(fā)現(xiàn)miR-29c-3p在HCC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)下調(diào)，miR-29c-3p 可通過靶向DNMT3B和LATS1 基因相關(guān)的Hippo信號通路在HCC中發(fā)揮相應(yīng)的抑癌作用。Guo 等[16]研究發(fā)現(xiàn)miR-663b在HCC組織細(xì)胞系中以低水平表達(dá)，miR-663b 過表達(dá)通過靶向Grb2 協(xié)同結(jié)合蛋白2 抑制HCC細(xì)胞的增殖和侵襲能力。

（三）miRNAs在肝癌多重耐藥性中的功能及作用機(jī)制

HCC是一種多血管原發(fā)性肝癌，具有進(jìn)展快、對傳統(tǒng)化療藥物耐藥等特點(diǎn)。肝切除和肝移植是當(dāng)前醫(yī)治HCC 最有效和領(lǐng)先的治療手段，化療藥物索拉非尼是HCC 晚期治療經(jīng)常使用的多激酶抑制劑。但由于腫瘤迅速獲得耐藥性，索拉非尼的作用是短暫的[6]。

已有研究表明，miRNAs 通過調(diào)節(jié)參與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)基因表達(dá)，在調(diào)控HCC細(xì)胞多重耐藥性方面發(fā)揮著重要作用[17]。長春新堿和阿霉素是體現(xiàn)HCC 高耐藥性的兩種化療藥物。當(dāng)miR-122和長春新堿（阿霉素）聯(lián)合使用時(shí)，HCC細(xì)胞對這些化療藥物的敏感性顯著增強(qiáng)[18]。Yahya等[17]研究調(diào)查了在HCC細(xì)胞中miR-122 與細(xì)胞周期分布和多重耐藥相關(guān)基因（ABCB1、ABCC1、ABCG2和ABCF2）表達(dá)的關(guān)系。研究顯示，用阿霉素處理或未處理的HepG2細(xì)胞中miR-122的過表達(dá)可下調(diào)MDR 相關(guān)基因（ABCB1和ABCF2）來調(diào)節(jié)細(xì)胞對化療藥物的敏感性，通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期（G0/G1期）停滯進(jìn)而抑制HCC細(xì)胞生長。Azumi 等[6]發(fā)現(xiàn)miR-181a在更具侵襲性的Hep3B HCC細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，其通過抑制Ras 相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族蛋白1 基因引起索拉非尼的耐藥性。為了進(jìn)一步確定 miRNAs在HCC 耐藥性中的作用，Zhuo 等[19]對Huh-7細(xì)胞中miRNAs 與多重耐藥性的關(guān)系進(jìn)行了分析。分別用阿德霉素、順鉑、卡鉑、絲裂霉素C和長春新堿對HCC Huh-7細(xì)胞系進(jìn)行濃度遞增的處理以開發(fā)耐藥亞系，結(jié)果miR-27b、miR-181a、miR-146b-5p、miR-181d和miR-146a為肝癌耐藥細(xì)胞亞系中表達(dá)差異最大的miRNAs，是靶向PTEN、P53和KRAS 等的關(guān)鍵蛋白。由此可見，這些miRNAs在HCC的多重耐藥性形成進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，可以作為調(diào)控耐藥性形成相關(guān)通路的有效靶點(diǎn)。監(jiān)測和靶向miRNAs 以阻止疾病進(jìn)展并克服耐藥性，是應(yīng)對HCC 發(fā)生發(fā)展的有效方案。

三、miRNAs在肝癌中的分子作用通路

HCC 中存在miRNAs的局部異常表達(dá)，它們多靶向于HCC 發(fā)生、發(fā)展密切聯(lián)系的基因和信號通路，從而調(diào)控HCC細(xì)胞的增殖和分化等重要病理進(jìn)程。根據(jù)miRNAs在HCC中發(fā)揮的不同作用，可將分子通路分為mTOR 通路、Wnt 通路、JAK/STAT 通路和MAPK 通路等[20]（表1）。

目前的研究表明，miRNAs 調(diào)控作用在HCC 中最具代表性的通路是mTOR，同時(shí)Wnt、MAPK和JAK/STAT 也受miRNAs表達(dá)水平的影響[20]。miRNAs 作為癌基因或抑癌基因，參與調(diào)控了HCC 發(fā)生過程中主要相關(guān)基因的表達(dá)，并為進(jìn)一步探討miRNAs在HCC 發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制研究提供了新思路。

四、miRNAs在肝癌中的應(yīng)用

（一）miRNAs 與肝癌的診斷

近年來研究人員通過大量實(shí)驗(yàn)對生物標(biāo)記物——甲胎蛋白、甲胎蛋白異質(zhì)體以及脫-γ-羧基凝血酶原的可靠性提出質(zhì)疑，尤其體現(xiàn)在良性肝病（肝炎和肝硬化）當(dāng)中。諸多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示甲胎蛋白及血清異常凝血本酶原的準(zhǔn)確性不高，在HCC 腫瘤小于3 cm的患者中，僅有50﹪顯示血清異常凝血本酶原活性升高[33-34]。甲胎蛋白是HCC 中應(yīng)用最廣泛的血清生物標(biāo)志物，但其敏感性和特異性僅為60﹪和90﹪[35]。因此早期HCC的診斷迫切需求一種新的生物標(biāo)志物。

理想的HCC 生物標(biāo)志物應(yīng)具有敏感性、特異性、可重復(fù)性、可降解性和非侵入性，能夠在血清、血漿、尿液或唾液等易獲取的組織中進(jìn)行評估[36]。Zhang 等[35]研究表明靶向三葉態(tài)因子3的miR-7-5p和miR-203a-3p 可成為HCC 早期診斷的潛在生物標(biāo)志物。Jin 等[36]研究證明4 種循環(huán) miRNAs（miR-1972，miR-193a-5p，miR-214-3p和miR-365a-3p）可以區(qū)分HCC 與其他非HCC個(gè)體。血液中循環(huán)miRNAs 以高度穩(wěn)定、無細(xì)胞的形式循環(huán)，有望成為HCC 早期診斷的新型潛在生物標(biāo)志物。Wang 等[37]研究發(fā)現(xiàn)血清中的miR-132和miR-212在HCC 診斷中具有潛在作用。此外，miR-132、miR-212和甲胎蛋白聯(lián)合使用提高了HCC的診斷效率，尤其是在敏感性和陰性預(yù)測值方面。這些結(jié)果均證明miRNAs能夠作為HCC 早期無創(chuàng)檢測的新型生物標(biāo)志物。除此之外，其他外泌體如環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）等通過其差異性表達(dá)水平，也在HCC 早期診斷方面發(fā)揮重要作用。Yu 等[38]研究發(fā)現(xiàn)在HCC細(xì)胞中circRNA-104718 與miR-218-5p 存在關(guān)聯(lián)并共同表達(dá)。circRNA-104718 可充當(dāng)內(nèi)源性RNA（ceRNAs）并通過靶向miR-218-5p/TXNDC5信號傳導(dǎo)途徑促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖，有望成為HCC診斷和治療的潛在靶標(biāo)。Li 等[39]研究表明lncRNA FAL1在HCC 中充當(dāng)致癌基因，LncRNA FAL1 可通過競爭性結(jié)合miR-1236 來加速HCC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，可能是未來HCC的新型診斷生物標(biāo)志物。

表1 miRNAs在肝癌中的分子作用通路

（二）miRNAs 與肝癌的治療

有研究證據(jù)發(fā)現(xiàn)miRNAs 作為一種針對HCC的新治療策略，在癌癥治療方面存在一定的潛在應(yīng)用價(jià)值。單個(gè)miRNAs 能夠調(diào)控?cái)?shù)百個(gè)靶基因，包含轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子和受體，并與許多靶基因構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，miRNAs 不具備免疫原性且不編碼蛋白，這些優(yōu)勢均證明了miRNAs在HCC 多基因疾病靶向治療方面的應(yīng)用價(jià)值。

目前，應(yīng)用miRNAs 治療HCC 主要有兩種方案。第一種是通過調(diào)控前體miRNA 糾正在HCC 中表達(dá)下調(diào)的miRNAs，從而抑制HCC的增殖或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自身的凋亡。Fornari 等[40]證實(shí)miR-122 可通過直接作用于cyclin G1 來抑制HCC細(xì)胞的生長，進(jìn)一步影響p53的轉(zhuǎn)錄活性及穩(wěn)定性，降低HCC的轉(zhuǎn)移能力；第二種是采用溶瘤病毒療法。與正常組織相比，溶瘤病毒更能感染和殺死癌細(xì)胞，它作用多種腫瘤組織，導(dǎo)致癌細(xì)胞溶解，對正常組織表現(xiàn)出輕微的毒性[41]。Callegari 等[42]通過利用miR-199的差異性表達(dá)，開發(fā)了一種有復(fù)制能力的溶瘤腺病毒Ad-199T，實(shí)現(xiàn)了特異性溶瘤病毒的表達(dá)和復(fù)制，并發(fā)現(xiàn)在miR-199的正常陽性肝實(shí)質(zhì)中，Ad-199T 復(fù)制受到抑制，溶瘤腺病毒Ad-199T可以在不引起明顯肝毒性的情況下顯示出治療HCC的潛力。此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，有望運(yùn)用反義法抑制處于上調(diào)水平的miRNAs。Krützfeldt 等[43]在小鼠體內(nèi)注入修飾過的反義RNA，發(fā)現(xiàn)肝臟等組織的miR-192、miR-194、miR- 16和miR-122的表達(dá)下調(diào)。如若能引入與具有癌基因性質(zhì)的miRNAs 互補(bǔ)的合成反義寡聚核苷酸，則可以有效地滅活HCC 中的miRNAs，延緩其增長。這些研究結(jié)果均表明miRNAs在HCC的發(fā)生和進(jìn)展中扮演著重要的角色，其生物學(xué)的復(fù)雜性為治療干預(yù)提供了一種新的作用機(jī)制，同時(shí)，在藥物治療與靶向性調(diào)節(jié)劑方面具有一定的發(fā)展前景。

（三）miRNAs 與肝癌的預(yù)后

與HCC 發(fā)生發(fā)展相關(guān)的一些miRNAs 已被證明能準(zhǔn)確預(yù)測HCC的不良預(yù)后。Shen 等[44]研究證實(shí)HCC組織中呈現(xiàn)高表達(dá)的miR-590-5p是HCC 侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的調(diào)控分子，其高表達(dá)水平顯示HCC 患者的預(yù)后較差。Li 等[45]研究發(fā)現(xiàn)HCC組織中miR-145表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期以及腫瘤分化相關(guān)。經(jīng)過Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型的多變量分析可得，miR-145 低表達(dá)患者的總生存期短于miR-145 高表達(dá)患者，miR-145的低表達(dá)是HCC 患者預(yù)后不良的一個(gè)監(jiān)測指標(biāo)。Ali 等[46]研究發(fā)現(xiàn)血清中miR-133b、miR-26a、miR- 107和miR-106 可能成為經(jīng)導(dǎo)管動脈化學(xué)栓塞治療HCC 患者的預(yù)后生物標(biāo)志物。因此，怎樣尋找具有高穩(wěn)定性和高準(zhǔn)確性的miRNAs，將為接下來的研究帶來新的挑戰(zhàn)。

miRNAs是近年來研究的熱點(diǎn)，研究進(jìn)展迅速。大量有關(guān)miRNAs在正常細(xì)胞功能和疾病中的作用機(jī)制研究表明，miRNAs在HCC 不同階段中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，是其發(fā)展過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子和主要參與者。miRNAs的侵襲、增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡以及相關(guān)的抑癌、致癌與耐藥性作用可能是HCC的主要調(diào)控機(jī)制，并已成為HCC 診斷、治療和預(yù)后評估中的一個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)。了解miRNAs在HCC 發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控機(jī)制，有助于開發(fā)更有效的新療法和分子治療藥物。

然而，在miRNAs的研究中也存在一些問題。許多研究處于實(shí)驗(yàn)階段，尚未真正應(yīng)用于臨床實(shí)踐。其次，作為HCC早期診斷和治療標(biāo)志物，miRNAs的安全性和可靠性也需要進(jìn)一步的研究。此外，關(guān)于外泌體miRNAs 當(dāng)前研究主要集中于觀察血清中miRNAs的含量，但HCC 發(fā)生的具體機(jī)制尚不完全清楚。因此，未來的研究應(yīng)將miRNAs在HCC 中的獲得性成果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，如開發(fā)可用的miRNAs 抑制劑等。對于miRNAs在HCC 早期診斷和治療中的安全性和可靠性的研究也值得關(guān)注。推進(jìn)miRNAs 與HCC 之間關(guān)系的深入研討，將會為進(jìn)行HCC 分子機(jī)理研究、臨床診療和預(yù)后評估產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，同時(shí)有助于進(jìn)一步提高醫(yī)生在抗肝癌診斷和治療中的臨床決策能力。