劉猛 劉娟 朱月敏 袁亞松 韓建鵬 王姣姣 盧雙動

急性腦梗死（acute ischemic stroke，AIS）又名急性缺血性腦卒中，發(fā)病速度快且病理進(jìn)程迅速，是世界上發(fā)病率、致殘率和死亡率較高的主要原因之一[1]。AIS 損傷可導(dǎo)致缺血區(qū)及周圍半暗帶腦組織細(xì)胞死亡及腦組織軟化壞死，進(jìn)一步加重病理進(jìn)程，對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[2]。但該病的具體發(fā)病機(jī)制仍然尚不清楚。目前，有關(guān)腦組織細(xì)胞的凋亡機(jī)制在AIS 中的作用受到廣泛關(guān)注。阿加曲班（Argatroban）是一種安全且高效的選擇性凝血酶抑制劑和抗凝血劑，臨床上用于治療48 h 內(nèi)AIS 患者，但其作用機(jī)制尚不明確[3]。本研究通過建立AIS 大鼠模型，觀察阿加曲班對損傷大鼠神經(jīng)功能的保護(hù)作用，并從腦組織細(xì)胞凋亡角度探討可能的機(jī)制，為阿加曲班在AIS 疾病的臨床應(yīng)用上奠定實驗基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料

1.實驗動物：體質(zhì)量為250～300 g的成年雄性SD 大鼠購于上海斯萊克實驗動物有限公司。飼養(yǎng)溫度為20℃～23℃，光照/黑暗周期為12 h，相對濕度為50 ﹪。所有實驗動物自由攝食攝水。飼養(yǎng)2 周后建立實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

2.實驗試劑：阿加曲班（美國Axxora公司）；Rat Apoptosis regulator BAX Elisa kit（Cusabio）、Rat B-cell CLL/lymphoma 2（BCL2）ELISA kit（中國武漢華美生物工程有限公司）；大鼠胱天蛋白酶3（Casp-3）ELISA Kit（美國R&D公司）；caspase-3 Rabbit mAb、Bcl-2 Rabbit mAb、Bax Rabbit mAb 以及b-actin Rabbit mAb（美國CST公司）；2,3,5-三苯基氯化四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色試劑（美國Sigma公司）；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

二、方法

1.大鼠大腦中動脈缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型的建立：手術(shù)前16 h 大鼠禁食禁飲。10 ﹪水合氯醛（0.35 g/kg）用于腹腔麻醉。將麻醉好的實驗動物仰臥固定于操作臺上，被毛暴露頸部，手術(shù)工具用75 ﹪的乙醇消毒待使用。手術(shù)刀沿著頸部正中處切開，暴露分離左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈。首先用動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈同時結(jié)扎頸總動脈近端和頸外動脈起始段，隨后從頸總動脈遠(yuǎn)端的切口處插入魚線。當(dāng)魚線插入深度為18 mm 時阻力增大，停止插入。

2.給藥方式：將大鼠分為假手術(shù)組（Sham組，不插入MCAO 拴線）；腦中動脈缺血模型組（MCAO組）；阿加曲班處理組（Argatroban組）。每組設(shè)置3個時間窗（0、6、12 h）取樣，每個時間窗組6 只實驗動物，其中3 只用于ELISA 檢測，另外3 只用于Western blot蛋白檢測。在建模后0、6、12 h 分別給予阿加曲班藥物處理。將0.45 mg的阿加曲班制成0.2 ml的溶液備用。實驗動物清醒后立即給藥。Argatroban組靜脈注射阿加曲班溶液0.2 ml。Sham組和MCAO組靜脈注射等體積的生理鹽水。

3.TUNEL 法檢測大鼠腦細(xì)胞凋亡情況：術(shù)后72 h，斷頭取腦處死實驗大鼠。將取出的腦組織制備成厚度約為6 μm的切片，置于載玻片上，多聚甲醛固定10～20 min，PBS 洗滌2次，每次10 min；所有樣品加入50 μl的TUNEL 檢測液，室溫孵育60 min，PBS 洗滌3次。最后用抗熒光淬滅封片液封片后置于熒光顯微鏡下觀察。凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光。計算細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）：AI（﹪）=陽性染色平均光密度（MOD）×表達(dá)面積率×100。

4.ELISA 法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)因子：ELISA法用于測定AIS 大鼠腦組織細(xì)胞凋亡相關(guān)因子caspase-3、Bax和Bcl-2的表達(dá)。收集腦組織樣本，加入預(yù)冷的蛋白裂解液勻漿后離心取上清，每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本100 μl，將反應(yīng)板充分混勻后置于室溫孵育2 h；洗滌液充分洗滌反應(yīng)板4～6次，并用濾紙印干；每孔加入100 μl的第一抗體工作液，充分混勻后置于37℃中孵育120 min；洗板4～6次；每孔加入酶標(biāo)抗體工作液100 μl，將反應(yīng)板置于37℃處理0.5 h；洗板4～6次；每孔加入底物工作液100 μl，室溫避光處理15 min；最后每孔加入100 μl 終止液終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀450 nm處檢測樣本吸光值。

四、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。腦組織細(xì)胞凋亡、caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、三組腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)情況

0、6、12 h Sham組的腦組織細(xì)胞凋亡數(shù)量隨著時間推移不斷增加，但表達(dá)量仍然較低（圖1）。與MCAO組比較，Sham組與Argatroban組腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)在不同時間點均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均 ＜ 0.05，表1）。

圖1 熒光顯微鏡下觀察不同時間點三組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況（TUNEL 熒光染色，×400）

二、三組大鼠腦組織細(xì)胞caspase-3表達(dá)情況

ELISA 結(jié)果顯示，0、6、12 h 三組大鼠腦組織細(xì)胞caspae-3表達(dá)比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）。與Sham組比較，MCAO組在不同時間點大鼠腦組織細(xì)胞caspase-3表達(dá)均升高且呈現(xiàn)出時間依賴性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均 ＜ 0.001）；與MCAO組比較，Argatroban組大鼠腦組織細(xì)胞caspase-3的表達(dá)均降低（P均 ＜ 0.01）。Western blot結(jié)果趨勢與ELISA 結(jié)果一致。（表2，圖2～3）

表1 不同時間點三組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)（﹪，± s，n = 3）

表1 不同時間點三組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)（﹪，± s，n = 3）

注：與Sham組比較，aP ＜ 0.01；與MCAO組比較，bP ＜ 0.05；n為實驗重復(fù)次數(shù)

分組 0 h 6 h 12 h Sham組 2.13±0.58 3.19±0.28 5.75±1.21 MCAO組 14.91±4.11a 24.75±3.88a 48.22±2.69a Argatroban組 4.22±1.01b 12.14±1.90b 28.45±7.84b F 值 23.233 56.389 57.888 P 值 0.013 0.004 0.004

表2 ELISA 檢測不同時間點三組大鼠腦組織細(xì)胞caspae-3表達(dá)（ng/ml，± s，n = 3）

表2 ELISA 檢測不同時間點三組大鼠腦組織細(xì)胞caspae-3表達(dá)（ng/ml，± s，n = 3）

注：與Sham組比較，aP ＜ 0.001；與MCAO組比較，bP ＜ 0.01；n為實驗重復(fù)次數(shù)

分組 0 h 6 h 12 h Sham組 1.08±0.07 1.21±0.03 1.48±0.03 MCAO組 2.32±0.12a 5.91±0.60a 7.31±0.27a Argatroban組 1.25±0.06b 3.26±0.22b 6.42±0.18b F 值 22.564 32.684 19.862 P 值 0.001 ＜0.001 0.004

三、三組大鼠腦組織細(xì)胞Bax表達(dá)情況

圖2 Western blot 結(jié)果檢測不同時間點三組大鼠腦組織細(xì)胞caspase-3蛋白表達(dá)定量分析

ELISA 結(jié)果顯示，三組大鼠在不同時間點腦組織細(xì)胞中Bax表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均 ＜ 0.01）。與Sham組比較，MCAO組不同時間點大鼠腦組織細(xì)胞Bax表達(dá)均升高（P均 ＜ 0.001）；與MCAO組比較，Argatroban組不同時間點大鼠腦組織細(xì)胞Bax表達(dá)均降低（P均 ＜ 0.01）。Western blot結(jié)果趨勢與ELISA 結(jié)果一致（表3，圖3～4）。

表3 ELISA 檢測不同時間點三組大鼠腦組織細(xì)胞Bax表達(dá)（ng/ml，± s，n = 3）

表3 ELISA 檢測不同時間點三組大鼠腦組織細(xì)胞Bax表達(dá)（ng/ml，± s，n = 3）

注：與Sham組比較，aP ＜ 0.001；與MCAO組比較，bP ＜ 0.01；n為實驗重復(fù)次數(shù)

分組 0 h 6 h 12 h Sham組 0.39±0.04 0.52±0.07 0.61±0.05 MCAO組 0.82±0.08a 1.00±0.05a 1.56±0.11a Argatroban組 0.45±0.03b 0.66±0.04b 1.09±0.07b F 值 21.563 21.236 48.353 P 值 0.003 0.003 ＜ 0.001

四、三組大鼠腦組織細(xì)胞Bcl-2表達(dá)情況

Western blot 結(jié)果顯示，與Sham組比較，MCAO組0 h 時大鼠腦組織細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜ 0.05），6 h 時表達(dá)升高（P＜ 0.001），12 h 時兩組表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。與MCAO組比較，Argatroban組不同時間點的Bcl-2蛋白水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均 ＜ 0.001，圖3，5）。

ELISA 結(jié)果顯示，與Sham組比較，MCAO組和Argatroban組0 h 時大鼠腦組織細(xì)胞Bcl-2表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均 ＞ 0.05），MCAO組6 h時 大 鼠腦組織細(xì) 胞Bcl-2表達(dá)升高（P＜ 0.001）。與MCAO組比較，Argatroban組大鼠腦組織細(xì)胞Bcl-2表達(dá)在6 h和12 h 時均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均 ＜ 0.001，表4）

表4 ELISA 檢測不同時間點三組大鼠腦組織細(xì)胞Bcl-2表達(dá)（ng/ml，± s，n = 3）

表4 ELISA 檢測不同時間點三組大鼠腦組織細(xì)胞Bcl-2表達(dá)（ng/ml，± s，n = 3）

注：與Sham組比較，aP ＜ 0.01；與MCAO組比較，bP ＜ 0.01；n為實驗重復(fù)次數(shù)

分組 0 h 6 h 12 h Sham組 0.17±0.02 0.30±0.06 0.32±0.04 MCAO組 0.19±0.21 1.07±0.08a 0.67±0.08a Argatroban組 0.21±0.03 1.56±0.05b 1.45±0.06b F 值 0.046 32.358 47.537 P 值 0.973 ＜ 0.001 ＜ 0.001

圖3 Western blot 檢測不同時間點三組大鼠腦組織細(xì)胞caspase-3、Bcl2和Bax蛋白表達(dá)

圖4 Western blot 檢測不同時間點三組大鼠腦組織細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)定量分析

圖5 Western blot 檢測不同時間點三組大鼠腦組織細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)定量分析

討 論

AIS是常見的破壞性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，也是全球第2 大致死原因，深入探究AIS的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制刻不容緩[4]。本研究通過建立大鼠MCAO 模型觀察阿加曲班對AIS 大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的神經(jīng)保護(hù)作用。結(jié)果表明，阿加曲班可通過減少腦細(xì)胞凋亡數(shù)量，抑制caspase-3和Bax表達(dá)，上調(diào)Bcl-2 水平從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

20 世紀(jì)80年代早期，日本醫(yī)療人員就將阿加曲班用于治療心肌梗塞、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療和腦血栓等臨床研究中[5]。與肝素不同的是，阿加曲班可獨立于抗凝血酶Ⅲ競爭性的抑制凝血酶而發(fā)揮抗凝血作用，同時還可抑制纖維蛋白形成[6]。一項急性缺血性腦卒中抗凝治療的臨床研究表明在AIS 治療早期，阿加曲班是唯一的一種具有明顯效果的抗凝血藥物[7]。有關(guān)阿加曲班的藥物安全性和可行性也曾被報道過。研究指出用阿加曲班治療后的腦梗死患者的出血風(fēng)險和死亡率并沒有額外增加，也沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的副作用和并發(fā)癥，而且并不影響其他抗凝血藥物的治療時間窗[8]。在腦出血的小鼠模型中，給予阿加曲班治療改善了損傷動物的神經(jīng)功能且降低了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡數(shù)量[9]。本研究表明，在MCAO組0～12 h 之間，阿加曲班能夠降低AIS 大鼠腦組織細(xì)胞凋亡數(shù)量，且在0 h 時與Sham組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這與前人的研究具有一致性[8-9]。

caspase-3是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶（cysteine-aspartic acid protease，caspase）家族成員，它作為關(guān)鍵蛋白在凋亡過程中發(fā)揮蛋白質(zhì)降解的作用[10]。caspase-3 最初以procaspase-3 形式存在且不具活性。在天冬氨酸殘基蛋白水解加工后，procaspase-3 轉(zhuǎn)化為具有活性形式的caspase-3 從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程[11]。caspase-3 可作為細(xì)胞凋亡指標(biāo)，其表達(dá)上調(diào)則表示細(xì)胞凋亡增加，反之細(xì)胞凋亡減少[12]。大量研究表明caspase-3 作為死亡蛋白酶在AIS 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中表達(dá)上調(diào)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)病12 h的AIS 患者血清中檢測到caspase-3的表達(dá)且在24 h 時達(dá)到巔峰，并伴隨有神經(jīng)細(xì)胞損傷加重和梗死灶體積擴(kuò)大的現(xiàn)象[13]。此外，在AIS 大鼠模型中可觀察到損傷大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)量及caspase-3表達(dá)均高于對照組，而給予相關(guān)藥物治療可有效修復(fù)神經(jīng)元細(xì)胞損傷，降低腦組織caspase-3蛋白表達(dá)[14]。陳靜等[15]在相關(guān)綜述中曾經(jīng)提到caspase-3的mRNA表達(dá)及蛋白水平在腦梗死損傷后均出現(xiàn)升高，在caspase-3表達(dá)陽性高峰期后6 h 出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的高峰期，這說明腦梗死誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡與caspase-3蛋白活性及裂解物的增加密切相關(guān)，并呈現(xiàn)出時間依賴性。本研究發(fā)現(xiàn)，在損傷0～12 h 內(nèi)，MCAO組大鼠腦組織細(xì)胞caspase-3表達(dá)與Sham組相比升高且具有時間依賴性，期間伴隨著腦組織細(xì)胞凋亡數(shù)量的遞增。

Bcl-2蛋白家族是線粒體膜完整性和功能的主要調(diào)控因子，根據(jù)結(jié)構(gòu)同源性可將其劃分為3個亞型：抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w等；促凋亡蛋白如Bax和Bak等以及包括Bad、Bid和noxa的BH3 only蛋白[16]。這些蛋白相互作用參與了線粒體介導(dǎo)的凋亡通路和非caspase 依賴的凋亡通路，從而介導(dǎo)了AIS引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制[17]。Bcl-2 主要位于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核周膜上，通過改變與促凋亡的Bax表達(dá)來調(diào)節(jié)膜的通透性[18]。在正常細(xì)胞中，Bcl-2和Bax處于平衡狀態(tài)，不發(fā)生凋亡。腦缺血損傷發(fā)生后，BH3-only蛋白與Bcl-2結(jié)合置換出Bax，增加線粒體膜的通透性導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。Bcl-2和Bax的功能相互拮抗，上調(diào)Bcl-2表達(dá)可抑制Bax 水平從而阻斷細(xì)胞凋亡過程[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2在AIS 0 h 時，其蛋白水平降低，隨后升高并在損傷6 h時達(dá)到巔峰值，這提示內(nèi)源性的Bcl-2對腦組織細(xì)胞缺血凋亡的敏感性，即Bcl-2 參與了早期的腦梗死病理進(jìn)程，這與蔣杞英等[21]研究具有一致性?；跈z測的間隔時間較短的影響以及細(xì)胞中Bcl-2 代償性升高的可能性，盡管ELISA 結(jié)果顯示損傷12 h后大鼠腦組織細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)仍高于Sham組，但Western blot 結(jié)果表明MCAO組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)在12 h 時已經(jīng)降低到與Sham組水平接近且無統(tǒng)計學(xué)意義，表明早期Bcl-2 參與早期腦梗死的病理過程可能存在時間延遲效應(yīng)。腦梗死6～12 h期間，隨著腦梗死損傷時間延長，MCAO組Bcl-2表達(dá)逐漸降低，Bax的水平進(jìn)一步升高，提示隨著損傷時間的遞增，Bcl-2的保護(hù)功能逐漸被抑制，而Bax的促凋亡效果更加明顯。阿加曲班治療后能進(jìn)一步上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，提示阿加曲班可通過增強(qiáng)MCAO 誘導(dǎo)的Bcl-2 水平消退而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。

腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡途徑是一個涉及多因素的復(fù)雜機(jī)制。其致病機(jī)制仍然需要更進(jìn)一步的探索。本研究表明阿加曲班能夠通過減少腦梗死誘發(fā)的腦組織細(xì)胞凋亡，抑制caspase-3和Bax表達(dá)同時上調(diào)Bcl-2 水平逆轉(zhuǎn)損傷引起的凋亡效應(yīng)，這為阿加曲班的臨床應(yīng)用奠定了更深的理論基礎(chǔ)。