腎癌是常見的惡性腫瘤，常起源于腎實質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)，多發(fā)于50～70歲人群。據(jù)統(tǒng)計，我國腎癌患者在成年惡性腫瘤病患中的構(gòu)成比約為2﹪～3﹪，且上升態(tài)勢明顯，尤其是在超過40歲的中年男性中腎癌的發(fā)病率呈顯著增長，也是威脅我國居民健康與生命的重要疾病之一[1]。目前腎癌常用的療法包括手術(shù)、放化療和中醫(yī)技術(shù)等，雖對控制病情有積極作用但綜合療效不甚理想，且遠期預后仍較差，而積極探討新的治療技術(shù)和靶點也是當前關(guān)于腎癌治療研究的熱點[2-3]。二氯乙酸（DCA）屬于一種小分子無機物，可對線粒體發(fā)揮作用使其去極化，且在多項實驗中均表現(xiàn)出了良好的誘導惡性腫瘤細胞凋亡、抑制其生長和增殖的作用[4-6]。尤其是在宮頸癌、卵巢癌中，且其作用機制有調(diào)控抑癌基因信號通路蛋白的表達及生物學效應(yīng)、調(diào)控有氧糖酵解等；也有研究證實二氯乙酸可抑制膀胱癌細胞株T24 克隆形成，抑制其侵襲和遷移，且發(fā)現(xiàn)是通過控制上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化實現(xiàn)此作用的[7-8]。據(jù)此推測二氯乙酸能夠影響人腎癌細胞株的侵襲和遷移能力，但該藥物是否具有此作用及其可能的機制仍需進一步探討。鑒于此，本研究特設(shè)計體外細胞實驗探討上述問題，以期為腎癌治療的研究提供新方向。

材料與方法

一、細胞、試劑及儀器

人腎癌細胞株A498（上?；鄯f生物科技有限公司）；RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；DCA（美國Sigma公司，純 度≥96﹪）；Giemsa染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；Trizol 試劑盒（美國Invitrogen公司）；蛋白提取試劑盒（美國Invitrogen公司）；上下游引物（由深圳晶美生物科技有限公司設(shè)計合成）；鼠抗人c-Jun 氨基末端激酶（JNK）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、p-JNK 單克隆抗體，山羊抗兔JNK、E-cadherin、N-cadherin、p-JNK 多 克 隆 抗 體（采 用辣根過氧化物酶標記）（美國Promega公司，一抗批號：002081506A、002092601B、002101203A、002110507C；二抗批號：002010303A、002060705B、002071112A、002050314C）。

INCO2/108 型CO2培養(yǎng)箱（德國Memmert公司）；SP21-318C 型酶標儀（北京中西遠大科技有限公司）；Millipore 型Transwell 小室（上海夏夷實業(yè)有限公司）；DSX500 型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；IX71 型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；T100 型聚光聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國Bio-Rad公司）；US61M 型基因電泳儀（美國MEDA公司）；DYCZ-24F 型蛋白電泳儀（北京六一儀器廠）。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)、鑒定和分組干預：取人腎癌細胞株A498 用含有10﹪濃度的胎牛血清和1﹪濃度的青鏈霉素溶液的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，注意需放置于CO2培養(yǎng)箱中，條件設(shè)置為5﹪濃度CO2、37℃。待細胞生長至對數(shù)期，分為4組，每組設(shè)置5個復孔，每孔細胞數(shù)5×105個。包括陰性對照組、DCA 低劑量、中劑量、高劑量組。預實驗發(fā)現(xiàn)DCA對人腎癌細胞株A498的半數(shù)抑制濃度（IC50）為38.5 mmol/L，且DCA 臨床等效劑量為5 mmol/L，故設(shè)置3個給藥濃度，低劑量即為臨床等效劑量，中劑量即為2×臨床等效劑量（即10 mmol/L），高劑量即為4×臨床等效劑量（即20 mmol/L），陰性對照組予以等容積無菌生理鹽水，均培養(yǎng)48 h。

表1 引物序列信息

2.侵襲能力檢測：采用Transwell 小室實驗檢測侵襲能力。將各組細胞按照1×105/ml 密度、200 μl接種于Transwell 小室上室，鋪有Matrigel 基質(zhì)膠。下室中加入RPMI 1640 培養(yǎng)基，其中含有600 μl 20﹪濃度的胎牛血清。按照上述條件于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以棉簽將基質(zhì)膠、上室未穿膜細胞輕輕擦去。采用甲醇固定，10 min 后采用0.1 ﹪濃度的Giemsa 染液染色，室溫下等待30 min。在光學顯微鏡下拍照觀察，放大100 倍，統(tǒng)計平均每個視野中侵襲細胞數(shù)。

3.遷移能力檢測：采用細胞劃痕實驗檢測遷移能力。將各組細胞接種于6孔板中，待細胞生長面積至90﹪后以10 μl 加樣槍頭進行劃痕，每孔劃痕1次。于48 h 后在倒置相差顯微鏡下觀察，細胞遷移率＝（1-愈合后間距/起始間距）×100﹪。

4.侵襲、遷移相關(guān)基因表達檢測：包括JNK、E-cadherin、N-cadherin mRNA表達，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測。Trizol 法提取總核糖核酸并予以反轉(zhuǎn)錄處理，配置反應(yīng)體系，總反應(yīng)體系為25 μl，各基因引物序列見表1。實施擴充反應(yīng)的條件為：95℃（10 min），40個循環(huán)：95℃（10 s）→60℃（20 s）→72℃（20 s），最后60℃（5 min）。分析并計算目的基因的相對表達量（2-△△Ct）。

5.侵襲、遷移相關(guān)蛋白表達檢測：包括JNK、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達及p-JNK 水平，采用Western blot 檢測。提取總蛋白、定量、上樣、電泳、封閉、孵育（室溫，1 h）。滴加一抗，孵育（4℃，過夜）。滴加二抗，孵育（37℃、2 h）。TBST洗滌2次，暗室曝光、顯影、定影、拍照后掃描。同一張膜上的其他蛋白在化學發(fā)光檢測后進行Strippingbuffer處理，經(jīng)封閉液封閉后進行后續(xù)抗體孵育等Western blot 操作。目的蛋白的相對表達量為目的蛋白與β-actin（內(nèi)參）的比值。

上述實驗均重復3次，取各項實驗結(jié)果的平均值作為本研究結(jié)果。

三、統(tǒng)計學分析方法

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析，侵襲活性、遷移率、JNK、E-cadherin、N-cadherin mRNA及蛋白表達、p-JNK 水平均符合正態(tài)分布和方差齊性檢驗，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、不同劑量DCA組與陰性對照組細胞侵襲活性對比

DCA 高劑量組侵襲活性高于DCA 中劑量組、DCA 低劑量組、陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.001）。（圖1，表2）

二、不同劑量DCA組與陰性對照組細胞遷移能力對比

DCA 高劑量組遷移率低于DCA 中、低劑量組及陰性對照組，各組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.001）。（圖2，表2）

表2 不同組干預后細胞侵襲活性及遷移率比較（± s，n = 3）

注：與陰性對照組比較，aP ＜ 0.05；與低劑量組比較，bP ＜ 0.05；與DCA 中劑量組比較，cP ＜ 0.05；n為實驗重復次數(shù)

分組 侵襲活性（個/視野）遷移率（﹪）陰性對照組 530.26±81.22 53.59±6.71 DCA 低劑量組 372.74±50.06a 36.26±5.01a DCA 中劑量組 167.89±47.12ab 23.95±4.20ab DCA 高劑量組 75.33±10.09abc 10.05±2.31abc F 值 73.243 73.510 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察不同組細胞侵襲活性（Giemsa 染色，×100）

圖2 倒置相差顯微鏡下觀察不同組細胞遷移能力（×100）

三、不同劑量DCA組與陰性對照組JNK、E-cadherin、N-cadherin mRNA表達對比

各組JNK mRNA 與蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）；DCA 高劑量組E-cadherin mRNA相對表達量高于DCA 中、低劑量組及陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.001）；DCA 高劑量組N-cadherin mRNA 相對表達量低于DCA 中、低劑量組及陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.001）。（表3）

四、不同劑量DCA組與陰性對照組JNK、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達及p-JNK 水平對比

DCA 高劑量組E-cadherin蛋白相對表達量高于DCA 中、低劑量組及陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.001）；DCA 高劑量組N-cadherin蛋白相對表達量、p-JNK 水平低于DCA 中、低劑量組及陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.001）。（圖3，表4）

表3 不同組JNK、E-cadherin、N-cadherin mRNA表達對比（± s，n = 3）

表3 不同組JNK、E-cadherin、N-cadherin mRNA表達對比（± s，n = 3）

注：與陰性對照組比較，aP ＜ 0.05；與低劑量組比較，bP ＜ 0.05；與DCA 中劑量組比較，cP ＜ 0.05；n為實驗重復次數(shù)

分組 JNK E-cadherin N-cadherin陰性對照組 0.81±0.11 0.85±0.12 0.95±0.11 DCA 低劑量組 0.83±0.12 1.02±0.11a 0.80±0.10a DCA 中劑量組 0.82±0.12 1.35±0.11ab 0.58±0.07ab DCA 高劑量組 0.81±0.10 1.52±0.12abc 0.42±0.06abc F 值 0.036 35.082 35.877 P 值 0.990 ＜ 0.001 ＜ 0.001

圖3 Western blot 檢測不同組JNK、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達及p-JNK 水平

討 論

目前關(guān)于腎癌的發(fā)病機制研究尚少，人們對其認識也尚淺。關(guān)于該病病因報道，大致可分為遺傳因素、精神因素、化學致癌物質(zhì)接觸和不良生活習慣等幾類，但仍需進一步研究[9-10]。由于目前人們對該病的病因病機認識少，且腎癌細胞侵襲和遷移的能力強，臨床治療難度大，因而目前尚缺乏行之有效的抗腎癌治療方案。目前臨床常用的化療藥物在體外細胞實驗和臨床試驗中均證實該藥物有一定的治療效果，但腎癌患者的預后仍較差，且遠期生存率低，仍需探討高效的用藥方案及其可能的作用機制，為臨床抗腎癌用藥的研究奠定基礎(chǔ)[11-12]。

本研究侵襲活性、遷移率的對比結(jié)果中顯示DCA 高劑量組抑制人腎癌細胞株A498 侵襲、遷移的作用最佳，DCA 中劑量組次之，DCA 低劑量組稍差，表明DCA 也有良好的抗人腎癌細胞株A498侵襲、遷移作用，且在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性。DCA 屬于一種無機物，分子量小，穿透性強，可快速穿透細胞膜對線粒體發(fā)揮作用使其去極化，進而抑制惡性腫瘤細胞生長，還可通過增強葡萄糖的有氧代謝控制糖酵解，限制惡性腫瘤細胞對能量的攝取和利用[13]。有研究指出，DCA在大腸癌細胞中的作用體外實驗中顯示該藥物可恢復線粒體膜電位，并且還可增加電壓門控通道蛋白的表達，增強其生物學活性發(fā)揮抗惡性腫瘤細胞作用[14]。既往一項國外有報道顯示，DCA 可能存在多種作用途徑削弱惡性腫瘤細胞的侵襲活性和轉(zhuǎn)移能力，與本研究部分結(jié)果也相符[15]。因此DCA 可抑制人腎癌細胞株A498的侵襲和遷移，在抗腎癌治療中顯示良好的研究價值和發(fā)展前景。

此外，在本研究關(guān)于DCA 抗人腎癌細胞株A498 侵襲和遷移的可能作用機制探討結(jié)果中顯示，DCA 3劑量組N-cadherin mRNA與蛋白表達、p-JNK均下降，而E-cadherin mRNA 與蛋白表達均升高，且DCA 高劑量組效用最佳，DCA 中劑量組次之，DCA 低劑量組效用稍不理想，可知DCA 可抑制p-JNK，下調(diào)人腎癌細胞株A498 N-cadherin mRNA與蛋白表達，上調(diào)E-cadherin mRNA 與蛋白表達。JNK 又被稱為應(yīng)激活化蛋白激酶，屬于哺乳類動物細胞中絲裂原活化蛋白激酶信號通路的一類，也是細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要調(diào)控因子。在正常情況下JNK 有2個磷酸化位點，p-JNK 水平較低，可抑制細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[16]。但是在惡性腫瘤細胞中，p-JNK 水平可在受到刺激后顯著升高，進而對細胞轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲等多種生物學行為發(fā)生作用。不少研究指出，p-JNK 水平升高可促使上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強癌細胞的侵襲和遷移能力，且在人腎癌細胞株中其水平也異常升高[17-19]。而在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生過程中，N-cadherin mRNA 與蛋白表達水平升高，E-cadherin mRNA 與蛋白表達下降。El Arem A 等[20]的報道中顯示，上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮源性腫瘤細胞發(fā)生和病情發(fā)展的重要基礎(chǔ)，而腎癌是臨床常見的上皮源性惡性腫瘤細胞類型，可出現(xiàn)細胞間連接減少表現(xiàn)，進而可導致細胞侵襲、遷移活性增強，對周圍臟器組織和解剖結(jié)構(gòu)的損傷風險增加，容易導致預后不良。上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化病理改變過程中，E-cadherin mRNA 與蛋白表達減少，而N-cadherin、Vimentin mRNA 與蛋白表達升高。在本研究中DCA 可抑制人腎癌細胞株A498 p-JNK 水平，下調(diào)N-cadherin mRNA 與蛋白表達，上調(diào)E-cadherin mRNA 與蛋白表達，且劑量越高成效越理想，推測該藥物可通過上述途徑發(fā)揮抑制人腎癌細胞株侵襲和遷移作用。

表4 不同組JNK、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達及p-JNK 水平對比（± s，n = 3）

表4 不同組JNK、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達及p-JNK 水平對比（± s，n = 3）

注：與陰性對照組比較，aP ＜ 0.05；與低劑量組比較，bP ＜ 0.05；與DCA 中劑量組比較，cP ＜ 0.05；n為實驗重復次數(shù)

分組 JNK E-cadherin N-cadherin P-JNK陰性對照組 1.20±0.08 0.13±0.03 0.95±0.11 0.95±0.10 DCA 低劑量組 1.22±0.09 0.37±0.08a 0.74±0.07a 0.68±0.07a DCA 中劑量組 1.19±0.10 0.89±0.14ab 0.25±0.04ab 0.29±0.05ab DCA 高劑量組 1.21±0.09 1.32±0.19abc 0.15±0.03abc 0.14±0.03abc F 值 0.102 90.188 151.479 148.525 P 值 0.958 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001

綜上，在人腎癌細胞株A498 中予以DCA 干預均可抑制其侵襲和遷移，且在一定范圍內(nèi)DCA的劑量越高作用越佳，該藥物抗人腎癌細胞株A498侵襲和遷移的作用可能與抑制p-JNK 水平，下調(diào)N-cadherin、mRNA 與蛋白表達，上調(diào)E-cadherin mRNA 與蛋白表達有關(guān)。本研究顯示出DCA 有良好的抗腎癌潛力，但仍存在明顯不足：（1）DCA對人腎癌細胞株A498 侵襲、遷移的調(diào)控作用是否存在其它機制仍不可知；（2）如何利用DCA 治療腎癌患者仍需要進一步探討。后續(xù)應(yīng)將上述問題作為研究的重點。