S100蛋白在脊椎動(dòng)物中是一個(gè)高度保守的家族，于1965年被首次發(fā)現(xiàn)，可與鈣離子合并調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外的各種活動(dòng)[1-2]。A16是其中一個(gè)成員，對(duì)于機(jī)體生理活動(dòng)十分重要，全身敲除S100A16 基因的純合子小鼠難以存活[3]。它的過(guò)表達(dá)又可促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞的脂質(zhì)合成，同時(shí)引起胰島素抵抗[4]。

胎球蛋白A是人類(lèi)AHSG基因的蛋白產(chǎn)物，是胰島素受體酪氨酸激酶的天然抑制劑，可抑制其將胰島素受體底物（insulin receptor substrates，IRSs）磷酸化，引起胰島素抵抗[5]。在肝臟中，過(guò)表達(dá)AHSG可引起肝臟脂肪變性[6]。本課題組之前的研究揭示，S100A16 可通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路促進(jìn)肝臟脂肪沉積，而胎球蛋白A的表達(dá)也受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的調(diào)控，引起代謝紊亂和肝臟脂肪變性[7-8]。由此推測(cè)，S100A16 可能調(diào)節(jié)胎球蛋白A的表達(dá)水平。

根據(jù)本課題組以前的研究得知，胰島素受體底物2（insulin receptor substrate-2，IRS-2）的表達(dá)水平與胰島素抵抗密切相關(guān)，發(fā)生胰島素抵抗時(shí)IRS-2表達(dá)下降[9]。因此，本研究旨在根據(jù)IRS-2蛋白的表達(dá)水平探究S100A16是否通過(guò)胎球蛋白A促進(jìn)HepG2細(xì)胞的胰島素抵抗。

材料與方法

一、藥物和試劑

HepG2細(xì)胞（ATCC?HB-8065TM）（美國(guó)ATCC）；100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿（430167）與六孔板（3516）（美國(guó)Corning Incorporated公司）；胰島素（I8830）（北京索萊寶科技有限公司）；吡格列酮（HY-13956）（美國(guó)MedChemExpress公司）；過(guò)表達(dá)S100A16 質(zhì)粒、干擾S100A16表達(dá)的shRNA 質(zhì)粒及Vector對(duì)照質(zhì)粒（南京金斯瑞生物科技有限公司）；蛋白A瓊脂糖珠（88846）、Lipofectamine 3000 Reagent（L3000001）（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（SH30022）（美國(guó)HyClone公司）；特級(jí)胎牛血清（04-001-1A）（以色列Biological Industries公司）；RIPA細(xì)胞裂解液（BB- 3201- 1）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X）（BB-3703- 1）（上海貝博生物有限公司）；NP-40細(xì)胞裂解液（P0013F）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；多克隆S100A16 抗體（11456-1-AP）、單克隆胎球蛋白A 抗體（66094-1-Ig）和多克隆GAPDH 抗體（10494- 1-AP）（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；多克隆IRS-2 抗體（#3089）（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）。

二、方法

1.研究設(shè)計(jì)與分組：用S100A16 抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后用蛋白質(zhì)譜分析尋找與S100A16 相互作用的蛋白，尤其關(guān)注是否與胎球蛋白A 存在相互作用。實(shí)驗(yàn)1 用干擾S100A16表達(dá)的shRNA質(zhì)粒、S100A16 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和Vector 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染Vector 質(zhì)粒的細(xì)胞作為對(duì)照，轉(zhuǎn)染shRNA和S100A16 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒干預(yù)作為處理組。用Western blot 驗(yàn)證S100A16是否調(diào)節(jié)胎球蛋白A的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)2以用胰島素慢性刺激細(xì)胞構(gòu)建胰島素抵抗模型，未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染Vector 質(zhì)粒的細(xì)胞作為對(duì)照，用轉(zhuǎn)染shRNA 質(zhì)粒干預(yù)作為處理組，驗(yàn)證胰島素抵抗條件下S100A16表達(dá)的降低是否可以使IRS-2的表達(dá)水平回升。實(shí)驗(yàn)3在胰島素抵抗模型中，無(wú)吡格列酮處理的作為對(duì)照，一部分細(xì)胞用10 μmol/L 吡格列酮進(jìn)行處理，用以探究S100A16對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的作用是否通過(guò)胎球蛋白A 進(jìn)行。構(gòu)建胰島素抵抗模型：細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)均勻接種于六孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)約80﹪融合度時(shí)以不含血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，用Lipofectamine 3000 Reagent 將干擾S100A16表達(dá)的shRNA 質(zhì)粒和Vector對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中等待4～6 h。在其中一組細(xì)胞培養(yǎng)基中加入胰島素，控制其濃度為0.1 μmol/L，36 h 后用于實(shí)驗(yàn)[9]。

2.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：HepG2 人肝癌細(xì)胞置于含10﹪胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，37℃、5﹪CO2飽和濕度的條件下培養(yǎng)，每隔1天換培養(yǎng)液1次。細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)均勻接種于六孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)到80﹪融合度時(shí)用Lipofectamine 3000 Reagent 分別將過(guò)表達(dá)S100A16 質(zhì)粒、干擾S100A16表達(dá)的shRNA 質(zhì)粒和Vector對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中。待細(xì)胞長(zhǎng)到90﹪以上融合度時(shí)，用于實(shí)驗(yàn)。

3.免疫沉淀和蛋白質(zhì)譜分析：將長(zhǎng)滿(mǎn)細(xì)胞的100 mm 培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液去除，加入300 μl 經(jīng)預(yù)冷含有蛋白酶抑制劑的NP-40細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞鏟將細(xì)胞刮下，于冰上緩慢搖晃20 min，使其充分裂解，然后于4℃離心機(jī)中13 800×g離心15 min，取上清液。用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。總蛋白每1 ml 加入100 μl胎球蛋白A 瓊脂糖珠，于4℃搖晃10 min，以除去非特異性結(jié)合蛋白，于4℃離心機(jī)中13 800×g離心15 min，取上清，將濃度稀釋至1 μg/μl，取500 μl 總蛋白加入10 μl S100A16 抗體，于4℃輕微搖晃過(guò)夜；加入100 μl胎球蛋白A，于4℃輕微搖晃6 h，于4℃離心機(jī)13 800×g離心5 s，棄上清，得瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物。用預(yù)冷的裂解液洗3 遍，再用60 μl 裂解液將復(fù)合物懸浮，放于95℃水浴鍋中10 min，取上清液，委托南京醫(yī)科大學(xué)分析測(cè)試中心用飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（AB Sciex TripleTOF?5600+，美國(guó)）進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析。

4.用吡格列酮抑制胎球蛋白A的表達(dá)：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞以上述方法用胰島素處理12 h 后，在其中一組細(xì)胞培養(yǎng)基中加入吡格列酮使其濃度達(dá)到10 μmol/ L，24 h 后用于實(shí)驗(yàn)[10-11]。

5.Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)：將六孔板中細(xì)胞培養(yǎng)液去除，PBS 洗2 遍，每孔加入80 μl 經(jīng)預(yù)冷含有蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞鏟將細(xì)胞刮下。將含有細(xì)胞的裂解液吸入容量為1.5 ml的EP 管中，于冰上裂解20 min，每5 分鐘振蕩1次，充分裂解后于4℃離心機(jī)中13 800×g離心15 min，取上清為細(xì)胞總蛋白。用BCA 法測(cè)定各組蛋白濃度。加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液后放于100℃水浴鍋中10 min，使其充分變性，制成蛋白樣品。根據(jù)蛋白濃度取各組樣品40 μg，以80 V 電壓用12 ﹪的SDS-PAGE 膠分離蛋白，以95 V的電壓用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用含5 ﹪脫脂奶粉的TBST（0.1 ﹪Tween-20）將膜于室溫下封閉1.5 h，將膜裁開(kāi)，印有不同蛋白的膜分別加入不同蛋白的一抗，于4℃冰箱輕微振蕩過(guò)夜。洗膜3次，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相同種屬二抗，室溫輕搖2 h，再洗膜3次，用ECL 顯影劑曝光。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用 SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Western blot 條帶灰度值（目的蛋白與內(nèi)參蛋白之比）以±s表示，組間比較采用成組t檢驗(yàn)，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、S100A16促進(jìn)胎球蛋白A的表達(dá)

質(zhì)譜結(jié)果顯示胎球蛋白A 可被S100A16 抗體富集并沉淀（圖1）。在轉(zhuǎn)染了干擾S100A16表達(dá)的shRNA 質(zhì)粒的細(xì)胞中，與轉(zhuǎn)染Vector 質(zhì)粒的細(xì)胞比較，胎球蛋白A蛋白表達(dá)（0.36±0.03 比0.20±0.03）水平降低（t= 6.439，P= 0.003），IRS-2表達(dá)（0.76±0.06 比0.90±0.04）水升高（t= 3.133，P= 0.035，圖 2a）；在轉(zhuǎn)染了S100A16 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，與轉(zhuǎn)染Vector 質(zhì)粒比較，細(xì)胞的胎球蛋白A蛋白表達(dá)（1.39±0.54 比2.85±0.25）水平升高（t=4.274，P= 0.013），IRS-2表達(dá)（0.73±0.11 比0.33±0.11）水平降低（t= 4.385，P= 0.012，圖2b）。

圖1 胎球蛋白A的質(zhì)譜

二、胰島素抵抗條件下S100A16 抑制IRS-2的表達(dá)

用慢性胰島素刺激后，細(xì)胞中S100A16蛋白表達(dá)（0.53±0.15 比1.03±0.19）水平上升（t= 4.027，P= 0.007），IRS-2蛋白表達(dá)（2.28±0.78比0.16±0.07）水平下降（t=5.428，P= 0.002）。與未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染Vector 質(zhì)粒的細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染shRNA 質(zhì)粒的細(xì)胞IRS-2蛋白的表達(dá)（0.11±0.04比1.65±0.48）水平上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.569，P= 0.005，圖3）。

圖2 S100A16 調(diào)節(jié)胎球蛋白A 以及IRS-2的表達(dá)

圖3 S100A16在胰島素抵抗條件下抑制IRS-2的表達(dá)

三、S100A16 通過(guò)胎球蛋白A 下調(diào)IRS-2的表達(dá)

與無(wú)吡格列酮處理比較，用10 μmol/L 吡格列酮處理IRS-2蛋白的表達(dá)（0.26±0.11 比0.52±0.05）水平上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.327，P= 0.005，圖4）。

圖4 S100A16 通過(guò)胎球蛋白A 下調(diào)IRS-2的表達(dá)

討 論

胰島素抵抗常見(jiàn)于2 型糖尿病、非酒精性脂肪性肝病等疾病，發(fā)生的機(jī)制尚不完全清楚。發(fā)生胰島素抵抗時(shí)，器官對(duì)于胰島素的敏感性大大下降，這就使得胰島素作為信號(hào)分子無(wú)法正常發(fā)揮它的作用。IRS-2蛋白，可通過(guò)下游通路調(diào)節(jié)一系列的糖脂代謝活動(dòng)，同時(shí)也能調(diào)控葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶等代謝關(guān)鍵酶的表達(dá)[12-13]。IRS-2 主要在細(xì)胞骨架上的高密度小體復(fù)合物中磷酸化，持續(xù)慢性胰島素刺激使其釋放入細(xì)胞液而無(wú)法與胰島素受體充分接觸并磷酸化，最終導(dǎo)致IRS- 2的降解[14]。

非酒精性脂肪性肝病是指除酒精外和其他明確的損肝傷因素所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過(guò)度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，可轉(zhuǎn)化為肝硬化和肝細(xì)胞癌，并參與2 型糖尿病的發(fā)病。根據(jù)最近的研究表明，在動(dòng)物模型和患有非酒精性脂肪性肝病的患者體內(nèi)，肝臟發(fā)生胰島素抵抗，IRS-2蛋白表達(dá)水平下降，使胰島素信號(hào)通路失去了對(duì)葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶等關(guān)鍵酶的抑制作用，從而增強(qiáng)了肝臟的糖異生作用[12]。另有研究表明，幾乎所有非酒精性脂肪性肝病的患者都存在肝胰島素抵抗，并且增加了2 型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[15]。因此，本研究對(duì)于非酒精性脂肪性肝病和2 型糖尿病的機(jī)制做出了補(bǔ)充。由于肝臟是人體主要的代謝器官之一，也是接受胰島素作用最重要的靶器官之一，又因?yàn)槟康牡鞍譙100A16、胎球蛋白A和IRS-2均與肝臟脂肪變性和代謝紊亂密切相關(guān)，本研究決定采用人肝癌細(xì)胞HepG2 進(jìn)行。

胎球蛋白A為分泌蛋白，主要在肝臟中表達(dá)，也可進(jìn)入血漿中發(fā)揮其生理作用，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可上調(diào)其表達(dá)水平并由此促進(jìn)肝臟脂肪變性[6，8，16]。本課題組之前的研究揭示S100A16 與熱休克蛋白A5 相互作用并通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)肝臟脂肪合成，由此推測(cè)胎球蛋白A的表達(dá)可能受到S100A16的調(diào)節(jié)[7]。質(zhì)譜結(jié)果提示S100A16 與胎球蛋白A 存在相互作用。Western blot 結(jié)果說(shuō)明S100A16 可上調(diào)胎球蛋白A的表達(dá)并促進(jìn)胰島素抵抗。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染了抑制S100A16的shRNA 質(zhì)粒后構(gòu)建胰島素抵抗模型，IRS-2表達(dá)水平較對(duì)照組2回升，說(shuō)明S100A16表達(dá)水平的下調(diào)可在一定程度上恢復(fù)IRS-2的表達(dá)水平，反映出胰島素抵抗條件下S100A16 通過(guò)抑制IRS-2的表達(dá)加強(qiáng)胰島素抵抗。而轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)S100A16 質(zhì)粒后誘導(dǎo)胰島素抵抗使細(xì)胞大量死亡。從文獻(xiàn)中得知，吡格列酮可作為胎球蛋白A蛋白的特異性抑制劑，在正常生理?xiàng)l件下也可發(fā)揮作用[10-11]。在胰島素抵抗模型中加入一定量吡格列酮，IRS-2表達(dá)水平較對(duì)照組3 上升，說(shuō)明S100A16對(duì)IRS-2的下調(diào)作用是通過(guò)胎球蛋白A 實(shí)現(xiàn)的，反映出胎球蛋白A是S100A16促進(jìn)胰島素抵抗過(guò)程中重要的一環(huán)。S100A16 調(diào)控胎球蛋白A的方法可能具有多種形式。除經(jīng)過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路外，它可能促進(jìn)AHSG基因的轉(zhuǎn)錄，因?yàn)镾100A16是胞內(nèi)小分子蛋白并可進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮促進(jìn)或抑制轉(zhuǎn)錄的作用[17]。這有賴(lài)于在以后的研究中凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

當(dāng)然，胰島素抵抗往往在一個(gè)機(jī)體的各個(gè)器官和組織中同時(shí)發(fā)生，主要體現(xiàn)在肝臟、骨骼肌和脂肪組織中，僅用HepG2細(xì)胞建立胰島素抵抗的細(xì)胞模型無(wú)法模擬胰島素抵抗患者的體內(nèi)環(huán)境，也不能普遍性地描述所有器官和組織發(fā)生胰島素抵抗時(shí)的情況。因此，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還有待進(jìn)行下去。另外，胎球蛋白A是由肝臟合成并釋放入血漿的分泌蛋白，它對(duì)于不同組織和器官的作用是否完全相同，以及S100A16的表達(dá)水平是否可以調(diào)節(jié)它的血漿濃度，這些都是可以進(jìn)一步研究的方向。

總之，根據(jù)以上結(jié)果結(jié)合本課題組之前的研究說(shuō)明，S100A16 可促進(jìn)胰島素抵抗，而胎球蛋白A為這個(gè)作用實(shí)現(xiàn)的途徑之一。