結(jié)腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，在我國的發(fā)病率和死亡率有明顯升高的趨勢，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康和生活質(zhì)量[1]。目前，結(jié)腸癌常用的手術(shù)治療有一定的局限性，而常用的放化療又有一定的毒副作用。隨著醫(yī)學(xué)水平的不斷提高，靶向基因治療成為近年來研究的熱點(diǎn)[2-4]。腫瘤細(xì)胞的惡性增殖和凋亡異常是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制，深入研究結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)對結(jié)腸癌的治療具有重要作用。

c-Myc是一種研究較為廣泛的癌基因，在結(jié)腸癌中異常高表達(dá)，可通過調(diào)控人類15﹪基因影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡等過程，與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5-8]。c-Myc啟動子結(jié)合蛋白1（c-Mycpromoter binding protein 1，MBP-1）是細(xì)胞核內(nèi)的一種調(diào)節(jié)因子，可通過與c-Myc的P2 啟動子特異性結(jié)合抑制c-Myc表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展[9]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，MBP-1在結(jié)腸癌組織中異常低表達(dá)，但其在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚[10]。本研究通過慢病毒介導(dǎo)MBP-1過表達(dá)，觀察其對結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響及其機(jī)制，旨在從分子水平上揭示MBP-1 調(diào)控結(jié)腸癌發(fā)展的機(jī)制，為結(jié)腸癌的靶向治療提供新靶點(diǎn)。

材料與方法

一、材料

1.主要試劑：人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116（美國ATCC）；胰酶、胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；青霉素-鏈霉素溶液、RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量檢測試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒（上海碧云天公司）；CCK-8 試劑、PCR 試劑盒和第一鏈cDNA 合成試劑盒（上海生工生物公司）；鼠抗MBP-1 單克隆抗體、Trizol 總RNA 提取試劑盒（晶美生物公司）；兔抗NF-κB p65 單克隆抗體（美國Cell Signaling公司）；二抗羊抗鼠或抗兔（北京中杉公司）；MBP-1過表達(dá)的重組慢病毒顆粒（LV-MBP-1-GFP）和空載體對照慢病毒顆粒（LV- GFP）由上海吉凱生物公司構(gòu)建并合成。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)、分組及病毒轉(zhuǎn)染：采用含10﹪胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基在5﹪CO2、飽和濕度和37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)HCT116 細(xì)胞。將體外培養(yǎng)的HCT116細(xì)胞用空載感染、對照慢病毒感染和MBP-1過表達(dá)慢病毒感染進(jìn)行處理。取生長良好的對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔5×105個細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞板上。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞約70﹪匯合率時，采用流式分選技術(shù)獲取穩(wěn)定表達(dá)的HCT116細(xì)胞株。

2.RT-PCR 檢測：收集待測的HCT116細(xì)胞，參照Trizol 總RNA 提取試劑盒說明書提取總RNA，并將RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)上海生工生物設(shè)計的內(nèi)參β-actin 引物（表1）參照PCR 試劑盒步驟進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，采用2-ΔΔCT法計算MBP-1 mRNA的相對表達(dá)量。其中，20 μl反應(yīng)體系：cDNA 2 μl，上下游引物各1 μl、Master Mix 10 μl和ddH2O 6 μl；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性60 s，94℃變性45 s、56℃退火30 s、72℃延伸30 s，30個循環(huán)。重復(fù)檢測3次。

表1 引物序列表

3.Western blot 檢測：收集待測的HCT116細(xì)胞，加RIPA細(xì)胞裂解液于冰上裂解提取總蛋白，BCA 法檢測總蛋白濃度后，行SDS-PAGE 電泳，每條泳道的上樣量為60 μg，每個樣品設(shè)3個重復(fù)。轉(zhuǎn)至PVDF 膜后，以封閉液（含50 g/L 脫脂奶粉）封閉2 h。特異性一抗（1:800）4℃下孵育過夜，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1:2 000）37℃孵育2 h。經(jīng)化學(xué)發(fā)光劑暗室內(nèi)顯影曝光后，Quantity One 4.6.2軟件分析MBP-1、NF-κB p65、c-Myc和CyclinD1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平。

4.CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖：收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個/ml。以每孔100 μl細(xì)胞懸液平鋪于96孔細(xì)胞板上，培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24、48、72 h后，以10 μl CCK-8處理4 h。酶標(biāo)儀檢測HCT116細(xì)胞在570 nm 波長處的吸光度（OD）值。實驗重復(fù)3次，取平均值納入統(tǒng)計。

5.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期：收集細(xì)胞，經(jīng)磷酸緩沖液洗滌后，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105個/ml。參照細(xì)胞周期檢測試劑盒說明書步驟檢查各組HCT116細(xì)胞的周期變化情況。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，MBP-1表達(dá)水平、OD 值、細(xì)胞周期、凋亡蛋白、NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)均以±s表示，三組間比較采用單因素方差分析，方差齊性采用F檢驗，若方差齊則組間比較采用LSD檢驗，若方差不齊則組間比較采用Dunnett檢驗。以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、LV-MBP-1-GFP 感染使結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞中MBP-1表達(dá)升高

與空白對照組比較，空載感染組細(xì)胞中MBP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。與空白對照組和空載感染組比較，MBP-1組細(xì)胞中MBP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜ 0.05，圖1，表2）。

圖1 Western blot 檢測結(jié)腸癌細(xì)胞中MBP-1蛋白表達(dá)

表2 三組細(xì)胞中MBP-1 mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較（± s，n = 3）

表2 三組細(xì)胞中MBP-1 mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較（± s，n = 3）

注：與空載感染組比較，aP ＜ 0.05；n為實驗重復(fù)次數(shù)

分組 MBP-1 mRNA MBP-1蛋白空白對照組 1.00±0.13 0.16±0.02空載感染組 1.02±0.15 0.18±0.01 MBP-1組 4.56±1.03a 0.72±0.10a F 值 103.086 259.543 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001

二、MBP-1過表達(dá)抑制結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞增殖

與空載感染組比較，MBP-1組細(xì)胞在48 h和72 h的OD 值降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜ 0.05，表3）。

表3 兩組結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞的OD 值比較（± s，n = 3）

表3 兩組結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞的OD 值比較（± s，n = 3）

注：n為實驗重復(fù)次數(shù)

分組 24 h 48 h 72 h空載感染組 0.45±0.02 0.60±0.02 1.13±0.05 MBP-1組 0.41±0.06 0.43±0.03 0.52±0.09 t 值 1.551 8.276 15.895 P 值 0.583 ＜ 0.001 ＜ 0.001

三、MBP-1過表達(dá)使結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞阻滯于S期

與空載感染組比較，MBP-1組細(xì)胞在G0/ G1期的百分比較低，而S期和G2/M期的百分比較高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均 ＜ 0.05）。與空白對照組比較，空載感染組細(xì)胞周期分布情況差別不大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05，表4）。

表4 MBP-1過表達(dá)對結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞周期的影響（± s，n = 3）

表4 MBP-1過表達(dá)對結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞周期的影響（± s，n = 3）

注：與空載感染組比較，aP ＜ 0.05；n為實驗重復(fù)次數(shù)

分組 G0/G1期 S期 G2/M期空白對照組 47.58±2.25 38.45±2.06 13.95±1.15空載感染組 46.06±1.89 39.12±2.18 14.81±1.02 MBP-1組 31.36±2.02a 45.64±3.21a 23.16±2.12a F 值 170.405 22.070 101.904 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001

四、MBP-1過表達(dá)誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

與空載感染組比較，MBP-1組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)水平降低，而Bax 與cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平均升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜ 0.05）。空白對照組和空載感染組之間Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均 ＞ 0.05，圖2，表5）。

圖2 MBP-1過表達(dá)對結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

表5 MBP-1過表達(dá)對結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響（± s，n = 3）

表5 MBP-1過表達(dá)對結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響（± s，n = 3）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；n為實驗重復(fù)次數(shù)

分組 Bcl-2 Bax cleaved caspase-3空白對照組 0.50 ± 0.03 0.56 ± 0.08 0.43 ± 0.06空載感染組 0.52 ± 0.10 0.55 ± 0.10 0.45 ± 0.08 MBP-1組 0.23 ± 0.02a 0.76 ± 0.11a 0.81 ± 0.11a F 值 62.681 13.295 55.873 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001

五、MBP-1過表達(dá)抑制結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞中NF-κB信號通路的活化

與空載感染組比較，MBP-1組細(xì)胞中NF- κB p65、c-Myc和CyclinD1蛋白的表達(dá)水平較低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜ 0.05）。與空白對照組比較，空載感染組中三種蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞ 0.05，圖3，表6）。

圖3 Western blot 檢測NF-κB p65、c-Myc和CyclinD1蛋白的表達(dá)

表6 MBP-1過表達(dá)對NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（± s，n = 3）

表6 MBP-1過表達(dá)對NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（± s，n = 3）

注：與空載感染組比較，aP ＜ 0.05；n為實驗重復(fù)次數(shù)

分組 NF-κB p65 c-MycCyclinD1空白對照組 0.56±0.10 0.82±0.13 0.60±0.06空載感染組 images/BZ_40_1544_1627_1545_1629.png0.61±0.13 0.79±0.15 0.62±0.09 MBP-1組 0.16±0.03a 0.43±0.05a 0.32±0.01a F 值 59.083 30.351 64.373 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001

討 論

本研究以慢病毒LV-MBP-1-GFP 感染成功上調(diào)MBP-1表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞的增殖活力受到抑制，細(xì)胞在G0/G1期比例降低，而S期和G2/M期細(xì)胞比例升高。MBP-1 基因是早期從宮頸癌細(xì)胞的cDNA表達(dá)庫中克隆出來的，位于細(xì)胞核內(nèi)的1p35 染色體上。作為原癌基因c-Myc的特異性抑制基因，可通過多種途徑介導(dǎo)細(xì)胞的增殖過程，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Shi 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，RNA 干擾下調(diào)MBP-1表達(dá)可通過上調(diào)Cyclin D1和Cyclin E蛋白的表達(dá)促進(jìn)骨肉瘤Saos-2細(xì)胞生長。結(jié)合本研究結(jié)果，提示MBP-1過表達(dá)可通過影響結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期進(jìn)程抑制結(jié)腸癌發(fā)展進(jìn)程。

本研究結(jié)果顯示MBP-1過表達(dá)后NF-κB信號通路相關(guān)蛋白NF-κB p65、c-Myc和CyclinD1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，MBP-1過表達(dá)的HCT-116細(xì)胞中NF- κB p65、c-Myc和CyclinD1蛋白的表達(dá)水平均明顯受到抑制。NF-κB信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，NF-κB p65是該途徑的關(guān)鍵因子，外源刺激引起NF-κB p65 進(jìn)而細(xì)胞核，激活NF-κB信號通路的活化，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，參與細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)，影響結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展[12-13]。CyclinD1是細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期不可或缺的周期蛋白，同時與c-Myc一樣也是一種公認(rèn)的原癌基因，是腫瘤生長的重要驅(qū)動子[14-15]。綜合本研究實驗結(jié)果，提示MBP-1過表達(dá)可通過抑制NF-κB信號通路激活進(jìn)而抑制結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展。

陳家驊等[16]指出，上調(diào)MBP-1表達(dá)可抑制c-Myc、Cyclin D1和Cyclin E表達(dá)使細(xì)胞在G0/G1期比例降低，細(xì)胞阻滯于S期和G2/M期，進(jìn)而使食管癌EC-109細(xì)胞的增殖能力減弱。Hsu 等[17]在胃癌的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，MBP-1 被miR-363 靶向下調(diào)后，可促進(jìn)SC-M1細(xì)胞生長和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。然而MBP-1在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的內(nèi)在作用機(jī)制尚未完全闡明，因此通過上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞中MBP-1的表達(dá)，觀察其對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響，可為結(jié)腸癌靶向治療研究奠定理論基礎(chǔ)。Ghosh 等[18]研究證實，MBP-1 可通過抑制MEK5 介導(dǎo)的NF-κB活化抑制前列腺癌細(xì)胞生長。由此推測MBP-1是否可通過調(diào)控NF-κB信號通路進(jìn)而參與結(jié)腸癌發(fā)生及發(fā)展過程，本研究經(jīng)試驗證明MBP-1 可能通過抑制NF-κB信號通路活化在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的抗癌作用。

MBP-1 基因與上游miRNA 或LncRNA及其他相關(guān)信號通路的相關(guān)性尚未明確，同時還需進(jìn)行體內(nèi)移植瘤實驗以驗證實驗結(jié)果，下一步研究可通過靶基因網(wǎng)站預(yù)測MBP-1是哪個miRNA的靶基因及其是否通過調(diào)控MBP-1 進(jìn)而參與結(jié)腸癌發(fā)生及發(fā)展過程，以此豐富結(jié)腸癌靶向治療的相關(guān)研究。