徐瑞 邱彤璐 梅杰, 沈書凝 朱一超,

乳腺癌是世界范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤之一，并且發(fā)病率逐年提高，已嚴(yán)重威脅到女性生命健康[1]。美國癌癥協(xié)會預(yù)測，2019年美國將有大約270 000 例新發(fā)乳腺癌病例，超過40 000 例死亡病例[2]。到目前為止，乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不完全明確。腫瘤轉(zhuǎn)移作為乳腺癌致死的重要原因，進(jìn)一步探究其發(fā)生的分子機(jī)制及相關(guān)因素對乳腺癌治療及患者預(yù)后評價均有重要作用。

大量研究表明，慢性炎癥與腫瘤之間存在明顯關(guān)系[3-5]。慢性炎癥的存在會增加該處發(fā)生腫瘤的風(fēng)險，腫瘤微環(huán)境中也被發(fā)現(xiàn)有大量炎癥因子浸潤。腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、趨化因子及細(xì)胞因子是構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的主要因素，其中間質(zhì)細(xì)胞包括炎癥因子，是腫瘤微環(huán)境間質(zhì)細(xì)胞中重要的組成成分[6]。腫瘤微環(huán)境中的炎癥是以炎癥因子為主導(dǎo)的非可控性炎癥，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要的作用[7]。

炎癥反應(yīng)在腫瘤發(fā)展的不同階段，包括發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移都起著重要作用。有研究表明，減少炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)可以抑制腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移[8]。這不僅為抗癌藥物的研發(fā)提供了靶點，也為探索腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了思路。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）是在腫瘤中與炎癥相關(guān)的化學(xué)介質(zhì)之一，參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[9]。已有研究報道，TNF-α與乳腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10]，但其具體的分子機(jī)制仍不完全明朗。本研究旨在探討TNF-α促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，提供控制乳腺癌轉(zhuǎn)移的新思路、新靶點。

資料與方法

一、一般資料

1.研究對象：本研究為前瞻性研究。本研究收集2018年1月至2019年4月就診于南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院乳腺外科，經(jīng)病理學(xué)確診為浸潤性乳腺癌的患者血液標(biāo)本共53 例。收集血液于EDTA 抗凝管內(nèi)，立即在低溫離心機(jī)離心后，將上層血漿收集到無菌離心管后保存于-20℃冰箱。本研究南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審查并批準(zhǔn)準(zhǔn)予實施。入組患者均簽署書面知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)空芯針穿刺活組織或者術(shù)后病理檢查確診為乳腺癌；（2）年齡20～70歲；（3）就診前均未接受任何輔助性治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）非原發(fā)性乳腺癌；（2）合并其他器官原發(fā)性惡性腫瘤；（3）妊娠狀態(tài)或處于哺乳期。

2.主要材料與試劑：TNF-αELISA試劑盒（CHE0019，北京四正柏生物科技公司），小G蛋白檢測試劑盒（美國Cytoskeleton公司），MDA-MB-231細(xì)胞（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫），重組人TNF-α（C600021，生工生物工程股份有限公司），二磷酸腺苷核糖基化因子6（ADP- ribosylation factor，Arf6）-T27N 質(zhì)粒（Dr.Julie G.Donaldson 惠贈，Laboratory of Cell Biology，美國國立衛(wèi)生研究院），LipofectamineTM2000 試劑盒（美國Invitrogen公司）。

二、方法

1.實驗分組：（1）評估臨床樣本中TNF-α含量高低的子實驗中，根據(jù)TNF-α在乳腺癌患者血漿中的表達(dá)分組，53 例乳腺癌患者分為高表達(dá)組（27 例）與低表達(dá)組（26 例）；（2）評估TNF-α是否對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移有影響的子實驗中，分為對照組和TNF-α誘導(dǎo)組；（3）評估Arf6是否為TNF-α誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移靶點的子實驗中，分為空載對照組（轉(zhuǎn)染空載體）、Arf6- T27N組（轉(zhuǎn)染Arf6-T27N）、空載轉(zhuǎn)染+TNF-α組（轉(zhuǎn)染空載體后加500 ng/ml TNF-α）、Arf6- T27N+TNF-α組（轉(zhuǎn)染Arf6-T27N 后加500 ng/ ml TNF-α）。

2.酶聯(lián)免疫檢測法（ELISA）：取剛?cè)朐何唇?jīng)藥物治療的乳腺癌患者清晨空腹靜脈血，EDTA 抗凝管取血，血漿保存于-20℃冰箱。應(yīng)用ELISA 酶聯(lián)免疫檢測法，嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書步驟操作，在450 nm處測定吸光度，每個樣本重復(fù)檢測3次。

3.細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：細(xì)胞置于10 ﹪胎牛血清（FBS）和雙抗（青霉素100 U/ml，鏈霉素100 μg/ ml）的DMEM 培養(yǎng)基中，5﹪ CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；0.25﹪胰蛋白酶消化細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80﹪時，用胰蛋白酶消化并接種至96孔板中。按不同分組進(jìn)行誘導(dǎo)或轉(zhuǎn)染，在37℃及5﹪CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞融合度至少達(dá)到80﹪時進(jìn)行劃痕操作。

4.細(xì)胞劃痕實驗：為了分析經(jīng)過不同處理后乳腺癌細(xì)胞的遷移能力，將MDA-MB-231細(xì)胞接種到96孔中。對53個臨床病例TNF-α的含量分析后選取500 ng/ml 進(jìn)行細(xì)胞系實驗，培養(yǎng)24 h 后，進(jìn)行劃痕操作，并用PBS 沖洗以去除細(xì)胞碎片。遷移4 h后，在室溫下將細(xì)胞用0.2﹪結(jié)晶紫染色20 min。圖像在遷移后0和4 h 使用尼康正置明視場光學(xué)顯微鏡采集。利用Image J軟件分析0 h和4 h 之間的遷移面積評價細(xì)胞遷移能力。

5.小G蛋白活化實驗（GLISA）：利用GLISA實驗對Arf6 等小G蛋白的活化程度進(jìn)行測定。乳腺癌細(xì)胞接種到6孔板中，用500 ng/ml的TNF-α誘導(dǎo)后檢測常見小G蛋白活性，用不同濃度TNF-α誘導(dǎo)后推測TNF-α對Arf6的最適宜作用濃度。嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書步驟操作，每個樣本重復(fù)檢測3次。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。TNF-α表達(dá)量、劃痕實驗相對愈合面積、小G蛋白相對活化程度等以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。TNF-α表達(dá)高低與臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法分析。以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、血漿TNF-α表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)的關(guān)系

乳腺癌患者血漿TNF-α的表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、臨床分期、ER表達(dá)狀態(tài)、PR表達(dá)狀態(tài)、HER2表達(dá)狀態(tài)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 9.294，P= 0.002）。與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者比較，已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中乳腺癌患者血漿TNF-α的表達(dá)量升高。（表1～2）

表1 血漿TNF-α表達(dá)量與乳腺癌病理參數(shù)間的關(guān)系

表2 不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的乳腺癌患者血漿TNF-α表達(dá)量

二、TNF-α對乳腺癌細(xì)胞遷移的影響

乳腺癌細(xì)胞劃痕后遷移4 h，與對照組比較，TNF-α誘導(dǎo)組的相對愈合面積（1.00±0.04 比2.34±0.25）增大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 9.295，P＜ 0.001，圖1）。

三、TNF-α對小G蛋白的誘導(dǎo)激活作用

與對照組比較，誘導(dǎo)組小G蛋白Arf6 相對活化程度升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.001），而其它小G蛋白的活化程度在TNF-α誘導(dǎo)前后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05，表3）。

圖1 正置明視場顯微鏡下觀察兩組乳腺癌細(xì)胞遷移能力（×10）

表3 TNF-α對常見小G蛋白活化程度的影響（x± s，n = 3）

四、干擾Arf6 活性對TNF-α介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞遷移的影響

與對照組比較，500、1 000 ng/ml TNF-αArf6 相對活化程度升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.001，表4）。用負(fù)顯性Arf6（Arf6-T27N）和其對應(yīng)空載體轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231。劃痕實驗結(jié)果顯示，與空載對照組比較，Arf6-T27N組的乳腺癌細(xì)胞Arf6 相對活化程度、相對愈合面積之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）；與空載轉(zhuǎn)染+TNF-α組比較，Arf6-T27N+TNF-α組在Arf6 相對活化程度、相對愈合面積均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.001，表5，圖2）。

表4 不同TNF-α濃度對乳腺癌細(xì)胞中Arf6 活化程度的影響（± s，n = 3）

表4 不同TNF-α濃度對乳腺癌細(xì)胞中Arf6 活化程度的影響（± s，n = 3）

注：與對照組比較，aP ＜ 0.001；與100 ng/ml 誘導(dǎo)組比較，bP ＜ 0.001。n為實驗重復(fù)次數(shù)

分組 Arf6 相對活化程度對照組 1.00±0.02 100 ng/ml 誘導(dǎo)組 1.13±0.11 500 ng/ml 誘導(dǎo)組 3.17±0.23ab 1000 ng/ml 誘導(dǎo)組 3.12±0.10a F 值 230.276 P 值 ＜ 0.001

表5 不同分組乳腺癌細(xì)胞的Arf6 相對活化程度及遷移能力（± s，n = 3）

表5 不同分組乳腺癌細(xì)胞的Arf6 相對活化程度及遷移能力（± s，n = 3）

注：與空載對照組比較，aP ＜ 0.001；與空載轉(zhuǎn)染+TNF-α組比較，bP ＜ 0.001。n為實驗重復(fù)次數(shù)

分組 Arf6 相對活化程度 相對愈合面積空載對照組 1.00±0.02 1.00±0.03 Arf6-T27N組 1.00±0.05 1.03±0.11空載轉(zhuǎn)染+TNF-α組 2.95±0.23a 2.33±0.14a Arf6-T27N+TNF-α組 1.92±0.13b 1.83±0.15b F 值 138.330 97.516 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001

圖2 正置明視場顯微鏡下觀察不同分組乳腺癌細(xì)胞的遷移能力（×10）

討 論

小G蛋白是一類分子量只有20～30 kD，具有GTP 酶活性的GTP 結(jié)合蛋白。已有大量研究證實小G蛋白在多種腫瘤的轉(zhuǎn)移中起到重要的作用[11-13]。據(jù)此推測，小G蛋白可能是TNF-α誘導(dǎo)乳腺癌轉(zhuǎn)移通路中的重要作用靶點。研究表明已知炎癥在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，而TNF-α已被證明是聯(lián)系這兩種過程的重要紐帶之一[14]。這種聯(lián)系的內(nèi)在機(jī)制與TNF-α的具體作用卻是因腫瘤而異的。目前已有許多研究證明TNF-α在不同腫瘤模型中與不同的細(xì)胞因子在表達(dá)量上有相關(guān)性。例如在前列腺癌與腎癌中TNF-α含量與IL-6、IL-8 等炎癥因子表達(dá)量呈正相關(guān)[15]。在胰腺癌中患者血漿TNF-α含量與腫瘤轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[16]。證實了TNF-α在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用。在某些腫瘤中，患者血漿TNF-α含量可以作為診斷依據(jù)，而在另一些腫瘤中TNF-α含量又能夠預(yù)測分期，并對預(yù)后有預(yù)測價值[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者血漿TNF-α含量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，即血漿TNF-α高表達(dá)的乳腺癌患者具有更高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險。而細(xì)胞實驗也證明，TNF-α可以增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞遷移能力。

TNF-α可促進(jìn)多種炎性細(xì)胞因子和趨化因子，從而影響腫瘤血管的形成和發(fā)展，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。如在卵巢癌中內(nèi)源性TNF-α與腫瘤細(xì)胞中趨化因子受體CXCR4及其配體CXCL12的表達(dá)增加有關(guān)，從而增加了腫瘤的轉(zhuǎn)移；在膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)中，外源性TNF-α也增加了趨化因子，內(nèi)源性TNF-α，以及血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)量，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[18]。在某些情況下TNF-α通過激活轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)基因激活相關(guān)細(xì)胞信號通路，影響腫瘤細(xì)胞的活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[19]。TNF-α還會直接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞基因損傷，可能具有抗凋亡或有絲分裂活性[18]，也可能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞間的相互作用，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞生成基質(zhì)金屬蛋白酶，改變免疫細(xì)胞的功能從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[20]。

Arf6是一類鳥嘌呤核苷結(jié)合蛋白。其中的Arf6是小GTP蛋白核糖基化因子家族重要成員之一[21]。Arf6 主要參與調(diào)節(jié)質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白組裝，在調(diào)節(jié)細(xì)胞胞質(zhì)分裂、細(xì)胞黏附、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程中也具有生理功能[22]。最近許多研究證實，Arf6蛋白的高表達(dá)和活化可能與乳腺癌、胰腺癌、肺癌等多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[23]。EGFR-Arf6 通路的激活在腫瘤惡性進(jìn)展過程中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，Arf6及其效應(yīng)物（即AMAP1）的過表達(dá)參與了EGFR -GEP100- Arf6- AMAP1 通路的形成和激活，此通路與許多癌癥的形成過程密切相關(guān)，如乳腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等[24-25]。就轉(zhuǎn)移性腫瘤而言，重組肌動蛋白細(xì)胞骨架是腫瘤細(xì)胞侵襲行為的關(guān)鍵事件。而與EGFR信號相關(guān)的Arf6 激活了SCAR/ WAVE，并將Rac1信號傳遞到Arp 2/3 復(fù)合物，進(jìn)而導(dǎo)致肌動蛋白細(xì)胞骨架重塑和邊緣延伸，并黏附于細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)乳腺腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，加入TNF-α誘導(dǎo)后，Arf6 活性升高，而該升高活性可在轉(zhuǎn)染Arf6-T27N后被顯著抑制。由此說明，Arf6是TNF-α介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞遷移通路中的重要下游分子。下調(diào)Arf6 活性，可以顯著抑制TNF-α介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞遷移，提示TNF-α/Arf6 通路在乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制中有著重要的意義。

盡管有許多研究證實了TNF-α與乳腺癌轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，但其具體機(jī)制還并不十分明確。因此選取乳腺癌為對象，探討乳腺癌患者血漿中炎癥因子TNF-α含量與乳腺癌轉(zhuǎn)移以及其他一些臨床指標(biāo)之間的相互關(guān)系，以及TNF-α通過激活A(yù)rf6 通路促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)機(jī)制的具體研究?？傊狙芯筷U明了TNF-α/Arf6 通路在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的重要作用，為乳腺癌轉(zhuǎn)移標(biāo)志物開發(fā)、靶向治療提供了新思路和新靶點。