毛會秀 陳美琦 陶然

摘 ? ? ?要：研究了彈性蛋白酶酶活力對野生與養(yǎng)殖全蝎活性成分含量及體外抑制腫瘤細(xì)胞生長的影響，篩選了彈性蛋白酶的最佳用量。依據(jù)全蝎混合酶解工藝中最佳提取條件，在彈性蛋白酶酶活力分別為2 000、1 000、400、200、20和0 U的條件下，分別測定野生與養(yǎng)殖全蝎中蛋白質(zhì)和糖胺聚糖的含量及對肺腺癌（A549）細(xì)胞的抑制率。結(jié)果養(yǎng)殖全蝎的蛋白質(zhì)含量顯著高于野生的，而糖胺聚糖含量則顯著低于野生的;養(yǎng)殖全蝎對肺腺癌細(xì)胞的抑制效果高于野生全蝎的抑制效果，且當(dāng)彈性蛋白酶的酶活力為200 U時，養(yǎng)殖全蝎對A549細(xì)胞的抑制效果最佳，IC50值為0.331 mg/mL。養(yǎng)殖全蝎對肺腺癌細(xì)胞具有較高的抑制作用，彈性蛋白酶的最優(yōu)酶活力為200 U。

關(guān) ?鍵 ?詞：野生全蝎;養(yǎng)殖全蝎;糖胺聚糖;蛋白質(zhì);抑制率

中圖分類號：R979.1 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ?文章編號：1671-0460（2020）02-0328-04

Abstract： To study the effect of different elastase activities on the active components and the inhibition of tumor cell growth in vitro of wild scorpions and cultured scorpions， the optimum use level of elastase was screened out. According to the optimum enzymatic hydrolysis conditions of scorpion， under the condition of 2 000， 1 000， 400， 200， 20 and 0 U of enzyme activity units， the contents of protein and glycosaminoglycan in wild scorpions and cultured scorpions were determined as well as the inhibition rates of lung adenocarcinoma （A549） cell. The results showed that the protein content of cultured scorpion was higher than that of the wild scorpion， but the content of glycosaminoglycan of cultured scorpion was lower than that of the wild scorpion. The inhibitory effect of cultured scorpion on lung adenocarcinoma cells was higher than the wild scorpion. Moreover， when the enzyme activity of elastase was 200 U， the inhibitory effect of cultured scorpion on A549 cells was the best， and the IC50 value was 0.331 mg/mL. Cultured scorpion had higher inhibitory effect on lung adenocarcinoma cells， and the optimal enzyme activity units of elastase was 200 U.

Key words： Wild scorpion; Cultured scorpion; Glycosaminoglycan;Protein; Inhibition rate

全蝎具有通絡(luò)止痛、攻毒散結(jié)等功效[1];半仿生-酶法是將半仿生提取法與生物酶結(jié)合起來的一種新的有效物質(zhì)提取方法。首先對中藥進(jìn)行預(yù)處理，破壞其細(xì)胞結(jié)構(gòu)，加快有效成分的充分溶出，加速提取進(jìn)程[2]，然后通過仿照人體腸道酸堿度、各種酶的種類以及酶解時間等條件，對樣品進(jìn)行體外酶解處理，從而獲得小分子的、具有更高生物活性的肽類物質(zhì)。近年來，全蝎單味藥、全蝎復(fù)方藥被廣泛地應(yīng)用于臨床中，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤[3]、抗炎以及提高機(jī)體免疫[4]等藥理作用，極具開發(fā)價值。隨著全蝎的開發(fā)，市場對其的需求量越來越大，為滿足市場的需要和實現(xiàn)全蝎藥材供應(yīng)的持續(xù)穩(wěn)定，全蝎養(yǎng)殖正在逐漸興起，大有逐步取代野生全蝎供應(yīng)的趨勢。但養(yǎng)殖全蝎能否完全替代野生全蝎仍需從各有效成分含量及藥理活性等方面進(jìn)行系統(tǒng)考查。桑曉[5，6]等通過采用HPLC法對比研究了野生全蝎與養(yǎng)殖全蝎中游離?；撬岬暮考盎旌厦附夂笠吧c養(yǎng)殖全蝎對肺腺癌細(xì)胞的抑制效果，結(jié)果表明養(yǎng)殖全蝎的?；撬岷亢蛯Ψ蜗侔┘?xì)胞的抑制效果均高于野生全蝎。焦方文[7]等采用酶解法對全蝎進(jìn)行單個酶篩選，得出胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶對A549細(xì)胞的抑制率均高于不加酶的全蝎水提液，并進(jìn)行了全蝎混合酶解工藝的優(yōu)化。因此，本項目采用混合酶解法，測定不同酶活力下野生與養(yǎng)殖全蝎的活性成分含量的變化，并以不同環(huán)境下的全蝎對A549細(xì)胞的抑制率為指標(biāo)，優(yōu)化酶解工藝中彈性蛋白酶的酶活力。

1 ?實驗部分

1.1 藥材

全蝎購自臨沂沂水，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)高德民副教授鑒定為正品。

1.2 試劑

牛血清蛋白（上海伯奧生物科技有限公司）;彈性蛋白酶等（上海源葉生物科技有限公司）;阿利新藍(lán)（上海麥克林生化科技有限公司）;Hyclone-1640細(xì)胞培養(yǎng)基（賽默飛世爾生物制品北京有限公司）;濃硫酸、硫酸銅等均為分析純。

1.3 儀器

UV9100B可見分光光度計（北京萊伯泰科儀器有限公司）;DNM-9602酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）。

1.4 細(xì)胞株

肺腺癌細(xì)胞由山東省立醫(yī)院提供。

2 ?實驗方法

2.1 ?全蝎粉的制備

將購買的全蝎凈選，優(yōu)選出成年蝎，洗凈，于凍干機(jī)中冷凍，打磨勻漿，冷凍干燥，得全蝎粉。

2.2 ?全蝎酶解液的制備

精密稱取1.000 0 g全蝎粉置于50 mL具塞錐形瓶，按1∶40料液比加入蒸餾水，超聲30 min，pH調(diào)至8.5，加入2 000 U的胰凝乳蛋白酶和2 000 U的胰蛋白酶，彈性蛋白酶的量分別為2 000、1 000、400、200、20和0 U，于40 ℃水浴鍋中保溫3 h，每隔1 h調(diào)1次pH值，離心，抽濾，得全蝎酶解液，將酶解液一部分用于含量測定，另一部分用于冷凍干燥得凍干粉。

2.3 ?蛋白質(zhì)和糖胺聚糖的含量測定

采用改良Lorry法[8]測定蛋白質(zhì)含量，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.002 2X+0.006 6。取“2.2”項中的全蝎酶解液，稀釋到一定體積，于650 nm波長處測定不同酶活力條件下蛋白質(zhì)的吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算不同酶活力的全蝎蛋白質(zhì)含量。

采用阿利新藍(lán)[6]染色法測定糖胺聚糖含量，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.633 4X-0.006 4。取“2.2”項中的全蝎酶解液，稀釋到一定量的濃度，于490 nm波長處測定不同酶活力條件下糖胺聚糖的吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算不同酶活力的全蝎糖胺聚糖含量。

2.4 ?體外抗腫瘤實驗研究

2.4.1 ?溶液配制

稱取一定量的不同酶活力的全蝎凍干粉，在無菌條件下，加入一定體積的 1640培養(yǎng)基，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，然后用1640培養(yǎng)基逐步稀釋，配成0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL藥物濃度。

2.4.2 ?MTT法檢測

將處于對數(shù)生長期的肺腺癌A549細(xì)胞用胰酶進(jìn)行消化，加入1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞濃度為1×106 mL的細(xì)胞懸液，然后以每孔100μL接種到96孔板上，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后，棄去上清液，每孔加入配好的藥物濃度100 μL，每個濃度重復(fù)5個孔，陰性對照組加入不含血清的1640培養(yǎng)基100 μL，陽性對照組加入100 μL 100 μg/mL的順鉑溶液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后，避光，每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h ，吸去上清液，每孔加入100 μL DMSO溶液，搖勻，于492 nm波長處測定OD值，并計算不同藥物濃度對A549的抑制率。

3 ?統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，用方差分析確定實驗之間的差異性及統(tǒng)計學(xué)意義，實驗數(shù)據(jù)以xs表示。

4 ?實驗結(jié)果

4.1 ?不同酶活力的野生與養(yǎng)殖全蝎蛋白質(zhì)和糖胺聚糖含量的對比

由表1可得，養(yǎng)殖全蝎蛋白質(zhì)含量均高于野生全蝎的蛋白質(zhì)含量，除酶活力為1 000 U外，其余酶活力的p值均小于0.01，說明兩者的蛋白質(zhì)含量存在極顯著性差異。

由表2可得，養(yǎng)殖全蝎的糖胺聚糖含量明顯低于野生全蝎的含量，且兩者的p值均小于0.01，說明野生全蝎與養(yǎng)殖全蝎的糖胺聚糖含量存在極顯著性差異。

4.2 ?不同彈性蛋白酶酶活力的野生與養(yǎng)殖全蝎對肺腺癌細(xì)胞抑制率的影響

由表3實驗結(jié)果可得，不同藥物濃度對A549的抑制效果大體上呈上升態(tài)勢，當(dāng)彈性蛋白酶的酶活力分別為2 000、1 000、400、200、20和0 U時，其IC50值分別為0.727、0.485、0.433、0.331、0.457和0.641 mg/mL，由此可得，當(dāng)彈性蛋白酶的酶活力為200 U時，全蝎混合酶解工藝對A549的抑制效果最佳。

表4實驗數(shù)據(jù)均為當(dāng)藥物濃度為1 mg/mL時，不同彈性蛋白酶酶活力的野生全蝎對A549的抑制率。當(dāng)藥物濃度低于1 mg/mL時，藥物對A549的抑制作用極弱，且在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，1 mg/mL的藥物濃度對A549的抑制率最高。

5 ?結(jié)論

在以前的研究中，野生全蝎酶解的彈性蛋白酶最佳用量為2 000 U[9]，由于彈性蛋白酶的市場價非常高，實驗中所使用的彈性蛋白酶的成本占到了整個酶解提取物總成本的80%;本研究成果在明確了同等條件下養(yǎng)殖全蝎抑制肺腺癌細(xì)胞株的效果優(yōu)于野生全蝎的基礎(chǔ)上，又進(jìn)一步探討了不同彈性蛋白酶用量對體外肺腺癌細(xì)胞株的影響，并進(jìn)而明確了最佳的彈性蛋白酶的用量為200 U，從而使彈性蛋白酶的用量減少了80%，使整個產(chǎn)品成本也降低了大約80%，具有極大的經(jīng)濟(jì)效益。

蛋白酶解過程不僅可以將大分子多肽酶解為小分子肽、寡肽及氨基酸，還會將一些本來在水中難溶的蛋白質(zhì)變?yōu)榭扇?，因此不同的酶用量會得到不同的蛋白質(zhì)含量，但糖胺聚糖不受此影響。養(yǎng)殖全蝎與野生全蝎之間在蛋白質(zhì)和糖胺聚糖之間的差異多是由其生長的環(huán)境條件決定的，與酶解的條件無關(guān)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖全蝎中的蛋白質(zhì)含量較野生全蝎豐富，而糖胺聚糖含量則野生全蝎中較多，養(yǎng)殖全蝎對A549細(xì)胞株的抑制率遠(yuǎn)高于野生全蝎，可能是因為養(yǎng)殖全蝎營養(yǎng)較有保證造成的。當(dāng)養(yǎng)殖全蝎的彈性蛋白酶酶活力為200 U時，其對A549細(xì)胞的抑制效果最佳。本文主要從野生全蝎與養(yǎng)殖全蝎的活性成分含量及抗腫瘤效果的對比研究中，優(yōu)化了全蝎酶解工藝中彈性蛋白酶的用量，降低了成本，并為養(yǎng)殖全蝎完全替代野生全蝎用于臨床提供了實驗基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]國家藥典委員會，中華人民共和國藥典;一部[M]，北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：143.

[2]張卉， 趙婷婷， 戴柳江， 尤曉娟， 郭增軍. 半仿生-酶法提取甘草中甘草酸的工藝研究[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2013，30（09）：9： 69-972.

[3]張敏，張永清.全蝎抗腫瘤藥理研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥工業(yè)，2003（01）：36-39.

[4]苗明三.全蝎粉對小鼠免疫功能的影響[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1997（04）：57-58.

[5]桑曉，王立娜，姜悅，馬明珠，王集會.HPLC柱前衍生化測定野生與養(yǎng)殖全蝎中游離?；撬岷縖J].化工時刊，2017，31（03）：21-24.

[6]桑曉，張瑞，王彥多，毛會秀，史磊.野生與養(yǎng)殖全蝎酶解后主要成分含量及抗腫瘤作用的對比研究[J].中南藥學(xué)，2018，16（02）：171-174.

[7]焦方文，王集會，鄒龑，張盼盼，劉玉紅，王俊香.全蝎粉酶解工藝最佳用酶的初步篩選[J].時珍國醫(yī)國藥，2015，26（10）：2407-2408.

[8]王舒玉，曹廣超，林偉江，高世杰，王集會.正交試驗法優(yōu)化發(fā)酵蜣螂粉中水溶性蛋白的提取工藝[J].當(dāng)代化工，2018，47（11）：2334-2337.

[9]Jiao FW，Wang JH，Liu YL，et al. Optimization of the Enzymolysis Conditions for Scorpion Peptides and Evaluation of its Antitumor Activity [J]. Current Signal Transduction Therapy，2016，11（1）：41-48.