關(guān)麗杰　董瑞芳

摘要：采用菌絲生長(zhǎng)速率法、孢子萌發(fā)法，研究了補(bǔ)骨脂提取物及0.2%異補(bǔ)骨脂查爾酮可溶液劑對(duì)黃瓜炭疽病菌的抑制活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂提取物對(duì)黃瓜炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)均有很強(qiáng)的抑制作用，其中對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制中濃度EC₅₀為62.973 mg/L，孢子萌發(fā)的抑制中濃度EC₅₀為8.213 mg/L。此外，0.2%異補(bǔ)骨脂查爾酮可溶液劑對(duì)黃瓜炭疽病有很強(qiáng)的防效，當(dāng)施藥濃度為375倍液時(shí)，防效即達(dá)到90.90%。以上結(jié)果表明，0.2%異補(bǔ)骨脂查爾酮可溶液劑是一種很有市場(chǎng)前景的防治黃瓜炭疽病的植物源殺菌劑。

關(guān)鍵詞：植物源殺菌劑；補(bǔ)骨脂提取物；黃瓜炭疽病菌；抑制率

中圖分類號(hào)：S436.421.1⁺9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002—1302（2016）01—0160—03

黃瓜炭疽病是黃瓜葉部的重要病害，在全國(guó)各地均有發(fā)生，是世界性的農(nóng)業(yè)問(wèn)題。當(dāng)前，生產(chǎn)上對(duì)黃瓜炭疽病的防治主要還是依賴于化學(xué)農(nóng)藥，但是化學(xué)農(nóng)藥防治存在成本高、農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、病原抗藥性增強(qiáng)等問(wèn)題，影響著人類的身體健康，且不符合可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的要求。陳義娟等發(fā)現(xiàn)茄子莖葉與辣椒莖葉提取液對(duì)黃瓜炭疽病菌具有一定的抑制效果。田菲菲等發(fā)現(xiàn)甘草、枸杞、金錢草等11種植物的80%乙醇提取物對(duì)黃瓜炭疽病菌都有一定程度的抑制作用。Lee等從中藥石菖蒲根莖的揮發(fā)油中分離出有效成分細(xì)辛腦，且發(fā)現(xiàn)500μg/mL細(xì)辛腦對(duì)黃瓜炭疽病病變的形成具有很強(qiáng)的抑制作用。Shimizu等發(fā)現(xiàn)內(nèi)寄生的鏈霉菌屬M(fèi)BCu-56菌株對(duì)黃瓜炭疽病有很好的防治作用，10⁹ CFU/mL菌株的防治效果為93%。本研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂乙醇提取物對(duì)黃瓜炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)、分生孢子萌發(fā)具有抑制作用，并開(kāi)展了0.2%異補(bǔ)骨脂查爾酮可溶液劑在室內(nèi)進(jìn)行黃瓜炭疽病的初步防治試驗(yàn)，旨在為其進(jìn)一步進(jìn)行田問(wèn)推廣及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1供試菌種和植物材料 供試菌種：黃瓜炭疽病菌（Colletrichum anthracnose），由沈陽(yáng)化工大學(xué)生物工程教研室保存。

供試黃瓜品種：冠軍密刺。

1.1.2供試藥劑 95%乙醇（沈陽(yáng)市新化試劑廠）；瓊脂（福建省泉州市泉港化工廠）；葡萄糖（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；0.2%異補(bǔ)骨脂查爾酮可溶液劑（補(bǔ)骨脂提取物質(zhì)量濃度為10%，沈陽(yáng)化工大學(xué)生物工程教研室制備）；75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑（有效成分含量75%，拜耳作物科學(xué)公司）。

1.1.3主要儀器LDZX-40BI立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；PH140A型光照培養(yǎng)箱/干燥箱（上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；HNP-1S水平流形超凈工作臺(tái)（南通滬南科學(xué)儀器有限公司）；SCOUT電子天平SCA210（叟豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司）；METILER AE240s電子分析天平（特勒-托利多儀器有限公司）；LRH-280微電腦控制生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；MOTIC BA220型顯微鏡（上海精密儀器儀表有限公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1補(bǔ)骨脂提取物的制備 提取溶劑為70%乙醇、固液比為1 g：5 mL、提取溫度為室溫、提取時(shí)間每次為3 h、合并濾液次數(shù)為2次以上，將所得的乙醇提取液在60℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行蒸餾濃縮，然后再在真空干燥箱內(nèi)進(jìn)行干燥。將干燥后的植物提取物密封好后，放人4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2補(bǔ)骨脂提取物對(duì)黃瓜炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法。用乙醇將補(bǔ)骨脂膏完全溶解分別配成濃度為243、81、27、9、3 mg/mL的溶液。取上述配制的5個(gè)濃度的溶液各1 mL，分別加入到100 mL，在50℃左右的PDA培養(yǎng)基中。充分混勻后，即配制成所設(shè)濃度含藥培養(yǎng)基，將1 mL的乙醇溶液加入到100 mL PDA培養(yǎng)基中作為對(duì)照，然后倒入直徑為90 mm的培養(yǎng)皿中制成平板，備用。使用直徑為6 mm的打孔器在事先在PDA平板上打孔，將在28℃下培養(yǎng)了3～5 d的供試病菌菌落邊緣處切取菌餅，并且接種到不同濃度的補(bǔ)骨脂平板和對(duì)照平板中央，每次處理重復(fù)4次，置于28℃下培養(yǎng)5～7 d，測(cè)量菌落的直徑。每種菌落取相交垂直線方向測(cè)其直徑，以其均值減去菌餅直徑即得菌落凈生長(zhǎng)直徑。

1.2.3補(bǔ)骨脂提取物對(duì)黃瓜炭疽病菌孢子萌發(fā)的抑制作用測(cè)定 將黃瓜炭疽病菌菌餅放置于菜豆培養(yǎng)基平板中央，置于28℃下培養(yǎng)7～10 d，待菌絲長(zhǎng)滿后，取長(zhǎng)勢(shì)良好的黃瓜炭疽病菌平板，加5 mL 1%的無(wú)菌葡萄糖水，用毛刷刷洗病原菌平板，8層紗布過(guò)濾，用1%的葡萄糖水溶液調(diào)至每個(gè)視野15～20個(gè)孢子，制備成孢子懸液。移取190μL的孢子懸液至32微孔板，加入10μL一定濃度的補(bǔ)骨脂乙醇溶液，使補(bǔ)骨脂提取物的終濃度為3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 mg/L。加入等量的乙醇為對(duì)照，等量1%葡萄糖水為空白，每個(gè)處理重復(fù)3次。每隔2 h鏡檢孢子萌發(fā)的狀態(tài)。當(dāng)空白孢子萌發(fā)率達(dá)到90%時(shí)，每處理隨機(jī)選取200個(gè)孢子，并以芽管長(zhǎng)度超過(guò)孢子短徑的1/2時(shí)視為萌發(fā)，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率，并計(jì)算抑制率。

1.2.4室內(nèi)盆栽試驗(yàn) 將芽勢(shì)一致的黃瓜種子播種在花盆中，當(dāng)植株長(zhǎng)到2葉1心時(shí)，噴施不同稀釋倍數(shù)的0.2%異補(bǔ)骨脂查爾酮可溶液劑，以75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑為對(duì)照藥劑，并設(shè)清水對(duì)照。24 h風(fēng)干之后，將黃瓜炭疽病菌孢子懸液均勻噴灑于植株上。接種后的試材放置在迷霧氣候箱中培養(yǎng)；溫度28～30℃，相對(duì)濕度RH為100%，接種24 h內(nèi)保證黑暗條件，24 h之后光照：黑暗=12 h：12 h處理；每處理10株黃瓜苗，重復(fù)3次；待對(duì)照充分發(fā)病后調(diào)查防病效果，調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)采用《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)》標(biāo)準(zhǔn)。

黃瓜炭疽病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)為葉片無(wú)病斑；1級(jí)為病斑面積占整個(gè)葉面積5%以下；3級(jí)為病斑面積占整個(gè)葉面積6%～10%；5級(jí)為病斑面積占整個(gè)葉面積11%～25%；7級(jí)為病斑面積占整個(gè)葉面積26%～50%；9級(jí)為病斑面積占整個(gè)葉面積50%以上。

1.2.5數(shù)據(jù)處理 （1）獨(dú)立回歸方法：采用最小二乘法計(jì)算獨(dú)立回歸方程，計(jì)算有效抑制終濃度（EC₅₀）。（2）顯著性檢驗(yàn)方法：采用Duncan's新復(fù)極差法在0.05水平進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1補(bǔ)骨脂提取物對(duì)黃瓜炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

補(bǔ)骨脂物提取物對(duì)黃瓜炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率與提取物濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，即隨著提取物濃度的升高，抑制率也依次增高。當(dāng)補(bǔ)骨脂提取物濃度為30、90、270、810、2 430 mg/L時(shí)，對(duì)黃瓜炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率分別為47.64%、48.51%、62.50%、83.12%、91.33%。其對(duì)黃瓜炭疽病原菌EC₅₀值為62.973 mg/L，說(shuō)明補(bǔ)骨脂提取物對(duì)黃瓜炭疽病原菌菌絲生長(zhǎng)具有較高的抑制活性（表1）。

2.2補(bǔ)骨脂提取物對(duì)黃瓜炭疽病菌孢子萌發(fā)的抑制活性

補(bǔ)骨脂提取物的濃度與黃瓜炭疽病菌孢子萌發(fā)的抑制率呈正相關(guān)，即隨著補(bǔ)骨脂提取物濃度升高，抑制率也增大。當(dāng)補(bǔ)骨脂提取物的濃度為3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 mg/L時(shí)，其抑制率分別為16.35%、32.91%、68.38%、97.74%、98.31%。由此可以得出補(bǔ)骨脂提取物對(duì)黃瓜炭疽病菌抑制作用的毒力回歸方程與ECso，其對(duì)黃瓜炭疽病原菌ECso值為8.213 1 mg/L（表2）。可見(jiàn)補(bǔ)骨脂提取物對(duì)黃瓜炭疽病菌的孢子具有很強(qiáng)的抑制作用，且隨著藥劑濃度的增加對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用明顯增強(qiáng)。

2.3室內(nèi)盆栽試驗(yàn)結(jié)果

室內(nèi)盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，0.2%異補(bǔ)骨脂查爾酮可溶液劑對(duì)黃瓜炭疽病有明顯的防治效果，且防治效果與可溶液劑的稀釋倍數(shù)呈現(xiàn)正相關(guān)，其中3 000倍液的防效為59.08%，防效好于75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑的效果（表3）。結(jié)果表明，0.2%異補(bǔ)骨脂查爾酮可溶液劑對(duì)黃瓜炭疽病有很顯著的防效，且其藥效要好于75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑。室內(nèi)盆栽試驗(yàn)為能夠進(jìn)行田問(wèn)實(shí)驗(yàn)或是真正應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中防治黃瓜炭疽病提供一定的數(shù)據(jù)支持與理論依據(jù)。

3討論

本研究通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速率法及孢子萌發(fā)法測(cè)定了補(bǔ)骨脂提取物對(duì)黃瓜炭疽病菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)抑制中濃度EC₅₀分別為62.973、8.213 mg/L，說(shuō)明補(bǔ)骨脂提取物對(duì)黃瓜炭疽病菌有極強(qiáng)的抑制作用。最后通過(guò)盆栽試驗(yàn)，測(cè)定了0.2%異補(bǔ)骨脂查爾酮可溶液劑對(duì)黃瓜炭疽病的防治效果，結(jié)果表明0.2%異補(bǔ)骨脂查爾酮可溶液劑對(duì)黃瓜炭疽病具有很好的防效。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)黃瓜炭疽病的防治，特別是植物源殺菌劑的研究較少，本研究首次發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂提取物對(duì)黃瓜炭疽病菌具有顯著的抑制效果。以往的報(bào)道中，陳義娟等發(fā)現(xiàn)茄子莖葉和辣椒莖葉的乙醇提取液對(duì)黃瓜炭疽有顯著的抑菌作用，當(dāng)濃度為20 g/L時(shí)，其對(duì)黃瓜炭疽病菌菌絲的抑制率分別為72.86%、72.57%，EC₅₀依次為6.962 7、8.254/L。在本研究中當(dāng)補(bǔ)骨脂提取物濃度為2.43g/L時(shí)，對(duì)黃瓜炭疽病菌菌絲的抑制率為91.33%，其中ECso為62.973 mg/L。田菲菲等發(fā)現(xiàn)甘草的乙醇提取物的質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，對(duì)黃瓜炭疽病菌分生孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)99.6%。在本研究中，補(bǔ)骨脂提取物的濃度為50 mg/L時(shí)，抑制率為98.31%?？梢?jiàn)，補(bǔ)骨脂提取物對(duì)黃瓜炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)均有很強(qiáng)的抑制作用

本試驗(yàn)結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂對(duì)黃瓜炭疽病菌具有很強(qiáng)的抑制作用，且補(bǔ)骨脂制劑作為植物源殺菌劑，它的作用靶標(biāo)或?qū)Σ≡淖饔靡话愣际嵌嘁蜃拥模什灰资拱袠?biāo)菌產(chǎn)生抗藥性。因此，補(bǔ)骨脂作為一種綠色環(huán)保的植物源農(nóng)藥對(duì)防治黃瓜炭疽病具有很好的應(yīng)用前景。本研究為田問(wèn)藥效實(shí)驗(yàn)及補(bǔ)骨脂的推廣利用提供了理論依據(jù)。