馬寶珠,劉世軍,唐志書(shū),李慧,張娛,宋忠興,崔春利,許洪波,劉紅波,張軍武,王少程
(陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心/秦藥特色資源研究開(kāi)發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育)/陜西省創(chuàng)新藥物研究中心,陜西 咸陽(yáng) 712083)
大棗為鼠李科植物棗(Ziziphus jujuba Mill.)的干燥成熟果實(shí)[1],在中國(guó)已有三千多年的歷史。中國(guó)各地均有栽培,世界上90%以上的大棗都產(chǎn)自中國(guó)[2]。雖然我國(guó)有著豐富的大棗資源,但大棗的深加工系列產(chǎn)品缺乏,使大棗產(chǎn)量和果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入不成比例。
隨著社會(huì)的發(fā)展,我國(guó)糖尿病人急劇增長(zhǎng),加上人們對(duì)自我身材完美的追求,“戒糖”這個(gè)概念逐漸滲透到人們的日常飲食中,而大棗含糖量高達(dá)50 %~80 %[2],讓人望而生畏?!疤恰币呀?jīng)讓人變得恐懼起來(lái)。
實(shí)驗(yàn)采用L9(34)正交試驗(yàn)法來(lái)優(yōu)化大棗醇提工藝,在降低大棗中單糖的同時(shí),最大化的保留大棗中的其它活性成分,讓人們能夠食用到含糖量低而又更健康的脫糖大棗,也為大棗的進(jìn)一步深加工提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司);高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津鑫博得儀器有限公司);KQ-300DE型數(shù)控超生波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津);電子分析天平(賽多利斯科儀器有限公司)。
葡萄糖(分析純,天津市大茂化學(xué)試劑);氫氧化鈉(分析純,天津市天力化學(xué)試劑有限公司);3,5-二硝基水楊酸(化學(xué)純,上??曝S實(shí)業(yè)有限公司);硫酸(分析純,成都市科隆化學(xué)品有限公司);亞硫酸鈉(分析純,天津市天力化學(xué)試劑有限公司);苯酚(分析純,天津市天力化學(xué)試劑有限公司);酒石酸鉀鈉(分析純,天津市天力化學(xué)試劑有限公司); 無(wú)水乙醇(分析純,安徽安特食品股份有限公司)。
實(shí)驗(yàn)所用大棗為購(gòu)于咸陽(yáng)市人人樂(lè)超市,為新疆和田大棗。
2.1.1 總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL的0.1 mg·mL-1葡萄糖溶液于具塞試管中,各加純化水至2 mL,精密加入6 %苯酚溶液(由80%苯酚現(xiàn)配)1.0 mL,搖勻后立刻加入濃硫酸5.0 mL,常溫放置30 min后冰水浴5 min,于490 nm處用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)其吸光度值[3]??瞻讓?duì)照則以2 mL純化水代替葡萄糖溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線圖則以濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行繪制,見(jiàn)圖1?;貧w方程:y = 17.211x - 0.0494; 相關(guān)系數(shù):R2= 0.9990。
2.1.2 樣品中總糖的測(cè)定方法 將樣品加純化水稀釋至合適的倍數(shù),于超聲波清洗器中超聲40 min,即得樣品溶液。測(cè)定前,將樣品溶液搖勻,精密移取2 mL于具塞試管中,加入 6% 的苯酚溶液1 mL,搖勻后立即加入濃硫酸5 mL。常溫放置30 min后冰水浴5 min,于490 nm處用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)其吸光度值??瞻讓?duì)照則以2 mL純化水代替葡萄糖溶液。最后根據(jù)“2.1.1”所得的總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程求得樣品溶液中總糖濃度。
2.2.1 DNS試劑的配置[4]主要有:
A液:稱取6.3 g DNS,21.0 g氫氧化鈉充分溶解于400 mL超聲脫氣后的純化水中。
B液:稱取182.0 g酒石酸鉀鈉溶解于400 mL脫氣后的溫水中,再加入5.0 g的苯酚,5.0 g的亞硫酸鈉,攪拌使其溶解,并放置至常溫。
最后將A液與B液混合均勻,倒入1 000 mL的棕色容量瓶中并定容至刻度線,即為配制好的DNS試劑。將DNS試劑冷藏于冰箱中備用。
2.2.2 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[5~7]精密移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL的1.00 mg·mL-1葡萄糖溶液于25 mL容量瓶中,各加純化水至2 mL,再精密移取5.0 mL DNS試劑加入容量瓶中??焖贀u勻,沸水浴5 min后,立即冷卻20 min置于冰水中,最后定容至刻度線,于493 nm處用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)其吸光度??瞻讓?duì)照則以2 mL純化水代替葡萄糖溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線圖則以橫坐標(biāo)為濃度,縱坐標(biāo)為吸光度進(jìn)行繪制,見(jiàn)圖2?;貧w方程:y = 31.442x - 0.0759;相關(guān)系數(shù):R2= 0.9992。
2.2.3 條件優(yōu)化 主要有:
(1)顯色條件。通過(guò)閱讀文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),苯酚-硫酸法測(cè)總糖的方法大都一致,而DNS法測(cè)還原糖時(shí),由于DNS試劑的配置比例不同等原因,顯色條件也有較大的不同。因此,針對(duì)還原糖的測(cè)定進(jìn)行顯色條件優(yōu)化。
(2)最大吸收波長(zhǎng)的選擇。按照“2.2.2”的測(cè)定方法進(jìn)行,精密移取1.00 mg·mL-1的葡萄糖溶液1 mL于25 mL容量瓶中,加水1 mL,再加5.00 mL DNS試劑,沸水浴3 min,冰水浴20 min,定容至刻度線,于450~1 600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描。掃描結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖可知,波長(zhǎng)為493 nm時(shí)有最大吸光度,故筆者實(shí)驗(yàn)還原糖測(cè)定時(shí)選用的波長(zhǎng)為493 nm。
(3)顯色劑用量的選擇。在6只25 mL容量瓶中,按照“2.2.2”的測(cè)定方法進(jìn)行,加入1 mg·mL-1的葡萄糖溶液1 mL,DNS溶液加入量依次為2、3、4、5、6、7 mL,沸水浴3 min。結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖可知,DNS用量為 4~17 mL時(shí),吸光度趨于穩(wěn)定,DNS用量為5 mL時(shí),吸光度最大,故選擇加入顯色劑的用量為 5 mL。
(4)顯色反應(yīng)時(shí)間的選擇。
在5只25 mL容量瓶中,按照“2.2.2”的測(cè)定方法進(jìn)行,加入1 mg·mL-1的葡萄糖溶液1 mL,DNS溶液5 mL,分別沸水浴3、4、5、6、7 min。結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知,顯色反應(yīng)時(shí)間為5 min時(shí)測(cè)定的吸光度最大,故選擇顯色反應(yīng)時(shí)間為5 min。
2.2.4 方法學(xué)考察 主要有:
(1)精密度實(shí)驗(yàn)。分別精密移取0.5 mL的1 mg·mL-1葡萄糖溶液于6只25 mL容量瓶,按照還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法測(cè)定吸光度值,測(cè)得吸光度分別為0.565、0.573、0.563、0.566、0.572、0.580,RSD=1.11%。結(jié)果表明,吸光度無(wú)明顯變化,說(shuō)明方法精密度良好。
(2)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。分別精密移取0.5 mL的1mg·mL-1葡萄糖溶液于6只25 mL容量瓶,按照還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法每隔5 min測(cè)一次吸光度,連續(xù)30 min考察穩(wěn)定性。測(cè)得吸光度分別為0.559、0.573、0.547、0.555、0.564、0.568,RSD=1.67%。結(jié)果表明,吸光度值30 min內(nèi)無(wú)明顯變化,說(shuō)明方法穩(wěn)定性良好。
(3)還原糖加樣回收實(shí)驗(yàn)。精密移取已知還原糖(大棗粉末還原糖)含量為0.34421 mg·mL-1的樣品溶液0.5 mL,按還原糖含量的80 %、100 %、120 %,加入對(duì)應(yīng)葡萄糖濃度的溶液0.5 mL,按照“2.2.2”還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定吸光度值,計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 還原糖加樣回收實(shí)驗(yàn)
結(jié)果顯示,還原糖平均加樣回收率為101.17%,RSD為4.27 %。符合要求。
2.2.5 樣品中還原糖的測(cè)定方法 將樣品加純化水稀釋至合適的倍數(shù),于超聲波清洗器中超聲40 min,即得樣品溶液。取1 mL樣品溶液并加純化水至2 mL于25 mL容量瓶中。加入5 mL的DNS溶液,搖勻后沸水浴5 min顯色,然后冰水浴20 min,再加純化水定容至刻度線,搖勻,于493 nm處用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)其吸光度。以2 mL純化水代替樣品溶液作空白對(duì)照。最后根據(jù)“2.2.2”還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程求得樣品溶液中還原糖濃度。
大棗中含有單糖(葡萄糖、果糖)、低聚糖和多糖,根據(jù)果糖易溶于乙醇,葡萄糖微溶于乙醇,而多糖難溶于醇,故可以利用單糖和多糖在乙醇溶液中的溶解度不同進(jìn)行簡(jiǎn)單分離,去除掉單糖部分。
用乙醇溶液對(duì)大棗粉末加熱回流提取,選取對(duì)醇提工藝影響較大的四個(gè)因素,乙醇濃度,提取時(shí)間,加醇量,提取次數(shù)進(jìn)行單因素考察,最后利用正交試驗(yàn)優(yōu)選出最佳的提取工藝。
2.4.1 大棗吸水率的考察 將大棗清洗、去核、烘干、粉碎并過(guò)4號(hào)篩,制的大棗粉末備用。
稱取50 g大棗粉末3份于燒杯中,加200 mL水,搖勻后浸泡至大棗粉末完全濕潤(rùn),濾過(guò),測(cè)量吸水率[8]。結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 大棗粉末吸水率測(cè)定結(jié)果
由表2可知,大棗粉末的吸水率為106.24%,約為大棗粉末量的1倍,故在第1次加液體時(shí)多加1倍量液體。
2.4.2 醇提工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)[9-10]實(shí)驗(yàn)對(duì)大棗進(jìn)行醇提主要為了在保留大棗中多糖及低聚糖的同時(shí),脫除掉還原糖。故以多糖及低聚糖含量和還原糖脫除率作為考察醇提效果的兩個(gè)主要指標(biāo),權(quán)重系數(shù)各為0.4。另外,將棗渣的產(chǎn)率作為次要指標(biāo),權(quán)重指數(shù)占0.2。采用綜合加權(quán)評(píng)分法,對(duì)醇提試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)選。
多糖及低聚糖含量=(總糖含量-還原糖含量)×100%
還原糖脫除率=
2.4.3 單因素實(shí)驗(yàn) 通過(guò)閱讀大量參考文獻(xiàn)得知,對(duì)醇提工藝影響較大的四個(gè)因素為乙醇濃度,提取時(shí)間,加醇量,提取次數(shù)[11~12]。對(duì)這四個(gè)因素分別進(jìn)行單因素考察,根據(jù)綜合評(píng)分結(jié)果,每個(gè)因素優(yōu)選出三個(gè)最佳水平。
(1)乙醇濃度的考察。準(zhǔn)確稱取5份50 g的大棗粉末,根據(jù)吸水率為106.24%,故選擇加入10倍量的乙醇,乙醇濃度分別為100%、90%、80%、70%、60%,加熱回流60 min。濾過(guò),將棗渣晾干,稱重。取適量棗渣,加水稀釋至合適濃度,測(cè)其總糖和還原糖含量。結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 乙醇濃度對(duì)醇提結(jié)果的影響
由表3可知,提取時(shí)乙醇濃度的不同,醇提效果也有較大的變化。隨著醇提濃度的變小,綜合評(píng)分也變小。當(dāng)提取時(shí)乙醇濃度為60%,不便于抽濾,故沒(méi)考察其醇提效果。綜合考慮,正交試驗(yàn)醇提濃度選擇80%、90%、100%這3水平。
(2)提取時(shí)間的考察。準(zhǔn)確稱取5份50 g的大棗粉末,各加入10倍量的無(wú)水乙醇,分別加熱回流提取20 min、40 min、60 min、80 min、100 min,濾過(guò),將棗渣晾干,稱重。取適量棗渣,加水稀釋至合適濃度,測(cè)其總糖和還原糖含量。結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 提取時(shí)間對(duì)醇提結(jié)果的影響
由表4可知,提取時(shí)醇提時(shí)間的變化,對(duì)醇提效果有一定的影響。醇提時(shí)間為20 min時(shí),醇提效果稍差,醇提時(shí)間為40 min、60 min、80 min、100 min時(shí),綜合評(píng)分相差不大。綜合考慮,正交試驗(yàn)醇提時(shí)間選擇40 min、60 min、80 min這3水平。
(3)加醇量的考察。準(zhǔn)確稱取5份50 g的大棗粉末,分別加入8、10、12、14、16、18倍量的無(wú)水乙醇,加熱回流提取60 min,濾過(guò),將棗渣晾干,稱重。取適量棗渣,加水稀釋至合適濃度,測(cè)其總糖和還原糖含量。結(jié)果見(jiàn)表5。
表5 加醇量對(duì)醇提結(jié)果的影響
由表5可知,提取時(shí)加醇量的不同,醇提效果也有較大的變化。隨著加醇量的變大,綜合評(píng)分也顯著增大。綜合考慮,正交試驗(yàn)加醇量選擇12倍、14倍、16倍這3水平。
(4)提取次數(shù)的考察。根據(jù)實(shí)際應(yīng)用及習(xí)慣,正交試驗(yàn)醇提次數(shù)直接選取1次、2次、3次。
2.4.4 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)“2.4.3”的單因素考察結(jié)果,設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)表[13]。見(jiàn)表6。稱取50 g大棗粉末,按正交試驗(yàn)表進(jìn)行醇提。見(jiàn)表7、表8。
表6 醇提因素水平設(shè)計(jì)
表7 醇提工藝正交試驗(yàn)結(jié)果
表8 醇提工藝方差分析
注:F0.05(2,2)=19.00,F(xiàn)0.01(2,2)=99.00
根據(jù)對(duì)醇提工藝正交試驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),4個(gè)因素對(duì)大棗醇提效果的影響程度為提取濃度(D)>加醇量(B)>提取次數(shù)(C)>提取時(shí)間(A)。每個(gè)因素下,3個(gè)水平的影響程度為A3>A1>A2,B3>B1>B2,C3>C1>C2,D3>D1>D2。根據(jù)對(duì)方差分析發(fā)現(xiàn),乙醇濃度具有極顯著性差異,加醇量具有顯著性差異。從節(jié)約資源、試劑等多方面綜合考慮,大棗最佳的醇提工藝為A1B3C1D3,用16倍量的無(wú)水乙醇提取1次,每次40 min。
2.4.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取大棗粉末50 g,加16倍量無(wú)水乙醇,又根據(jù)吸水率為106.24 %,故加850 mL無(wú)水乙醇,加熱回流提取40 min。將回流液抽濾,取濾餅即棗渣烘干,稱重,并取棗渣測(cè)其總糖和還原糖。重復(fù)三次,結(jié)果見(jiàn)表9。
表9 醇提工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果
結(jié)果表明,在此最佳工藝條件下,所得到的大棗渣中多糖及低聚糖的含量由原大棗粉末的41.08%升至59.14%,還原糖的脫除率高達(dá)70.22%,棗渣的率為68.00%,說(shuō)明此醇提工藝條件穩(wěn)定,可靠。
大棗含有單糖,低聚糖和多糖。單糖即還原糖,含量測(cè)定采用3,5-二硝基水揚(yáng)酸法;總糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法;大棗中多糖和低聚糖的含量測(cè)定目前都是通過(guò)總糖與還原糖含量之差來(lái)反映。不同地區(qū),不同品類中棗的還原糖差異較大,牛林茹,李濤等人通過(guò)對(duì)7種大品類紅棗還原糖含量測(cè)定后發(fā)現(xiàn)還原糖含量占總糖還量的44.9%~74.4%[14]。大棗中的單糖(主要為葡萄糖和果糖[15])對(duì)人體不太友善。葡萄糖被人體小腸吸收后容易引起血糖升高,不宜短時(shí)間內(nèi)大量食用;果糖可以轉(zhuǎn)化成為脂肪,是導(dǎo)致人體的肥胖的重要因素。大棗中低聚糖又分為普通低聚糖和功能性低聚糖,功能性低聚糖具有低熱量、調(diào)節(jié)腸胃菌群結(jié)構(gòu)、有利于鈣的吸收、降低膽固醇、防止腹瀉和便秘等生理作用[16]。但是目前對(duì)大棗低聚糖的研究不夠深入,具體含量也不得而知,但安曉南發(fā)現(xiàn)大棗低聚糖中兩種較高的糖為蔗果三糖和蔗果四糖,均不具有還原性[17]。大棗多糖的保肝、抗氧化、抗疲勞、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等多種作用目前也是毋庸置疑的[18~20]。
采用正交試驗(yàn)優(yōu)化大棗的醇提工藝,將大棗中的還原糖盡可能多的脫除,最大化地保留大棗中的低聚糖、多糖及其它成分,從而得到適合不同人群的“脫糖大棗”,豐富大棗系列健康產(chǎn)品。