張曉虎，雷郁佳，張子璇，呂 晨，郭元園

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

引言

木蘭科植物南五味子(SchisandrasphenantheraRehid.et Wils.)的干燥成熟果實(shí)，富含蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、有機(jī)酸、果膠等食用物質(zhì)，且含有五味子甲素、乙素、丙素、五味子醇甲、醇乙、五味子酯甲等活性成分，除具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心等藥用功效外，還具有保肝護(hù)肝、免疫促進(jìn)、抗衰老、抗腫瘤等保健作用，被譽(yù)為“藥食同源”植物[1～4]。

五味子果實(shí)因含天然抑菌活性成分而得以長期存放，如木脂素類的主要成分之一的五味子甲素，具有明顯的抗炎、抗病毒作用，能抑制多種病原菌及致病菌，因此南五味子中有效活性成分具有開發(fā)為天然食品防腐劑資源的潛力[5～7]。閆紹悅等[8]提取了五味子中的活性成分木脂素，將其用于三種常見標(biāo)準(zhǔn)菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌)的抑菌試驗(yàn)表明，五味子甲素提取物對被測菌有明顯的抑制作用。張媛媛等[9]研究了五味子中粗提物抗菌成分對毛霉和金黃色葡萄球菌的影響，并在面制食品的貯藏保鮮中取得了較好效果。

研究選取秦嶺腹地陜西省商洛市知名“五大商藥”之一的南五味子為對象，采用響應(yīng)面法優(yōu)化南五味子甲素提取工藝，以AB-8型大孔樹脂對南五味子甲素分離純化并進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，將南五味子甲素與殼聚糖、檸檬酸、氯化鈣復(fù)配制備防腐保鮮液，并以爛果率、pH值、失重率、硬度等為指標(biāo)檢測對后熟香蕉保藏試驗(yàn)效果，以期為南五味子甲素應(yīng)用于果蔬類食品的防腐保鮮提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 主要有:

(1)材料：南五味子果實(shí)(2018年9月采摘于商洛市山陽縣高壩鎮(zhèn)南五味子種植基地)；市售黃熟香蕉(購自商洛市華潤萬家超市)。

(2)試劑：五味子甲素標(biāo)品(購自上海金穗生物科技有限公司)；無水乙醇，95%乙醇，甲醇，以上均為分析純；蒸餾水，脫乙酰度≥90的殼聚糖，食品級檸檬酸，氯化鈣，胰蛋白胨，葡萄糖，瓊脂，生理鹽水，AB-8型大孔吸附樹脂。

(3)菌種：枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、變形桿菌(購自西安市長安區(qū)瑞昇化玻儀器供應(yīng)站)。

1.1.2 主要儀器 SI-234型電子天平，北京賽多利斯儀器有限公司；JP-500C型高速多功能粉碎機(jī)，永康市久品工貿(mào)有限公司；N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；pHS-25型數(shù)顯pH測試儀，上海始恒儀器有限公司；GY-3型果實(shí)硬度計(jì)，上海精密儀器儀表有限公司；LC-20A型高效液相色譜儀，日本島津有限公司。

色譜條件：色譜柱，ODS-3(C18)(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(75∶25)；流速：1 mL·min-1；檢測波長：254 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：1.0 μL。

1.2 研究方法

1.2.1 材料預(yù)處理 南五味子果實(shí)先經(jīng)清洗、50℃殺青、風(fēng)干后，恒溫(60℃)干燥2 h；再經(jīng)粉碎、過篩(40目)，最后置于干燥的廣口瓶中備用。

1.2.2 五味子甲素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 五味子甲素標(biāo)準(zhǔn)品溶液：將精密稱取4 mg的五味子甲素標(biāo)品溶解在裝有甲醇的10 mL容量瓶中，定容，搖勻，制備成濃度為400 μg·mL-1的五味子甲素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

五味子甲素標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別將上述制備的標(biāo)品溶液精確吸取0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mL加到10 mL的5個容量瓶中，用甲醇稀釋并標(biāo)定，根據(jù)1.1.2色譜柱條件重復(fù)進(jìn)樣并測定峰面積。以五味子甲素的相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制五味子甲素標(biāo)準(zhǔn)曲線[10,11]見(圖1)，得出線性回歸方程：y=0.1699x-0.5046，R2=0.9986。

1.2.3 五味子甲素的提取 在100 mL燒杯中加入一定濃度和比例的乙醇，將準(zhǔn)確稱取的5.0 g南五味子粉末浸泡在其中5 min，充分混合并攪拌均勻，然后置于水浴溫度75℃的條件下重復(fù)提取三次，抽濾，合并濾液并旋蒸，回收乙醇，再次抽濾，稱量記錄體積。

1.2.4 五味子甲素得率的測定 吸取五味子甲素濃縮提取液1.0 mL于25 mL容量瓶中用甲醇定容，同1.1.2色譜柱條件重復(fù)進(jìn)樣三次，將測得的峰面積求出平均值，結(jié)合回歸方程按式(1)計(jì)算粗提取液中南五味子甲素的得率[12]。

(1)

式中：C—五味子甲素濃度(μg·mL-1)；N—溶液的稀釋因子；V—稀釋劑體積(mL)；—提取物樣品體積(mL)；W—五味子甲素質(zhì)量(g)。

1.2.5 單因素試驗(yàn) 按1.2.3五味子甲素提取方法，分別考察液料比(1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14)，提取溫度(50、60、70、80、90℃)，乙醇體積分?jǐn)?shù)(40、50、60、70、80 %)，提取時間(0.5、1、1.5、2、2.5 h)對商洛南五味子甲素提取率的影響。

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 依據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)原理，設(shè)計(jì)3因素、3水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，經(jīng)Design-Expert 8.0.6軟件分析得出試驗(yàn)數(shù)據(jù)，優(yōu)化提取工藝參數(shù)。

1.2.7 驗(yàn)證性試驗(yàn) 依照響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳提取工藝條件，對南五味子甲素的得率測定進(jìn)行三次平行試驗(yàn)，與預(yù)測值相比較，評價模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合程度。

1.2.8 五味子甲素的初步分離純化 大孔吸附樹脂的前處理：將AB-8型樹脂在95%的乙醇中浸泡24 h，待完全膨脹后，把較碎的和細(xì)小的樹脂剔除，將剩余的大孔樹脂裝入一個干凈的大燒杯中，用95%乙醇反復(fù)沖洗，直到洗滌液與水以1∶5混合卻還澄清時，再繼續(xù)用去離子水沖洗到?jīng)]有醇味，沖洗完成后將其浸泡在去離子水中備用[13]。

吸附量與解吸量的計(jì)算：在250 mL具塞磨口三角瓶中裝入2.0 g預(yù)處理過的樹脂，精確添加100 mL濃度已知的南五味子甲素提取液，使樹脂與提取物完全混合。搖動裝樹脂的三角瓶2 h，每10 min搖動一次，每次30 s。放置24 h直至飽和吸附，過濾，測定濾液中南五味子甲素的濃度[14]。大孔樹脂對南五味子甲素的吸附量與吸附率按式(2)與式(3)計(jì)算。

Qe1=(C0-C1)V0/M

(2)

(3)

式中：Qe1—吸附量(μg·g-1)；C0—南五味子甲素在粗提液中的質(zhì)量濃度(μg·mL-1)；V0—粗提液的體積(mL)；C1—南五味子甲素在吸附液中質(zhì)量濃度(μg·mL-1)；M—濕樹脂的質(zhì)量(μg·g-1)；Q1—吸附率。

飽和吸附后，用去離子水清洗樹脂，再加入已知濃度的乙醇溶液100 mL，振搖2 h，每15 min振搖1次，每次30 s，放置24 h至解吸完全，取解吸液，測定南五味子甲素質(zhì)量濃度[15]。大孔樹脂的解吸量與解吸率按式(4)與式(5)計(jì)算。

Qe2=C2V1/M

(4)

(5)

式中：Qe2—解吸量(μg·g-1)；C2—解吸后南五味子甲素濃度(μg·mL-1)；V1—解吸液體積(mL)；Q2—解吸率。

1.2.9 抑菌試驗(yàn) 菌懸液的制備：選擇活化菌接入裝有適量無菌水的試管，將混懸液震蕩搖勻，制備成濃度為1×105cfu·mL-1的菌懸液備用。

南五味子甲素抑菌能力的測定：先將待測菌的懸浮液分別取0.1 mL加入已制備好平板培養(yǎng)皿中，涂抹均勻。所提取的南五味子甲素被配制成100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、0 mg·mL-16個不同濃度梯度后，將121℃干熱滅菌2.5 h的直徑為6 mm的濾紙小圓片完浸泡在以上制備的不同濃度南五味子甲素溶液中，浸漬完全后取出并干燥。把經(jīng)過以上處理的濾紙片放入含有待測菌的培養(yǎng)皿的表面中心，之后在37℃的恒溫環(huán)境中培養(yǎng)24 h，用十字交叉劃線法測定抑菌區(qū)的直徑[16～18]。

1.2.10 香蕉保藏試驗(yàn) 按表1的配方制備不同處理的保鮮防腐液。

表1 不同防腐保鮮液的配方 (%)

將完整無損、大小均勻、果形端正且飽滿的黃熟香蕉選為供試材料，用無菌水清洗除去污垢后，分為若干組(每組7根)，然后放置在室內(nèi)自然晾干；將配制的防腐保鮮涂膜液均勻涂布在處理好的香蕉上并晾干，放到無菌托盤上用聚乙烯薄膜保鮮膜密封，每個組合重復(fù)3組，在固定溫濕度(25℃、65%)的恒溫培養(yǎng)箱貯藏7 d，測定觀察有關(guān)指標(biāo)，選擇最佳復(fù)配組合[19,20]。

爛果率：以果實(shí)表皮腐爛面積與總面積比例P為依據(jù)，將腐爛程度分為4個等級。P=0，0級；030%，3級[21]。按式(6)(n=3)計(jì)算爛果率。

(6)

式中：Nt—時間為t時的腐爛級別；Rt—時間為t時各腐爛級別相應(yīng)的果實(shí)數(shù)，個；Rmax—腐爛最高級別；N0—試驗(yàn)香蕉果實(shí)總數(shù)，個。

失重率：按式(7)計(jì)算香蕉果實(shí)失重率。

(7)

式中：m0—初始質(zhì)量，g；m1—貯藏一段時間后的質(zhì)量，g。

果實(shí)硬度：用果實(shí)硬度計(jì)重復(fù)測量香蕉果實(shí)不同三個部位的硬度，取平均值。

pH值：剝離香蕉皮后，準(zhǔn)確稱取10 g，切碎放入裝有100 mL蒸餾水的燒杯中浸泡15 min，振搖3～4次，過濾得到浸出液，用pH分析儀浸入待檢浸出液中，數(shù)秒后取出，讀取pH值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 料液比對南五味子甲素得率的影響 由圖2可知，隨著料液比的增加，南五味子甲素提取量逐漸增大，當(dāng)時間達(dá)到1∶10時，提取量已達(dá)到最大。繼續(xù)增加料液比，提取量無明顯改變。因此，考慮到節(jié)約且高效的原則，選取最佳料液比為1∶10。

2.1.2 提取溫度對南五味子甲素得率的影響 由圖3可知，提取溫度對南五味子甲素提取量的影響呈先升后降的趨勢，溫度在50～80℃時，提取量隨提取溫度升高而增加，當(dāng)提取溫度超過80℃時，提取量明顯下降。因此，選擇80℃為較佳的提取溫度。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對南五味子甲素得率的影響 由圖4可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對南五味子甲素提取量的影響呈先升后降的趨勢。乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時提取量最高。因此，選取80%作為較佳的乙醇濃度。

2.1.4 提取時間對南五味子甲素得率的影響 由圖5可知，隨著提取時間的增長，南五味子甲素的提取量呈增加趨勢，當(dāng)提取時間超過2 h后，提取量則明顯減少。因此，選擇2 h為較佳的提取時間。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果 基于單因素試驗(yàn)，在固定料液比為1∶10的前提下，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時間這三個對商洛南五味子中五味子甲素得率影響較大的因素設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果見表2。

2.2.2 回歸分析 用Design-Expert 8.0.6設(shè)計(jì)軟件擬合表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到二次多元回歸方程模型：

Y=3.47+0.30A+0.031B+0.12C+0.057AB-0.18AC+0.048BC-0.73A2-0.094B2-0.14C2

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果

由表3可知，P<0.0001方程的模型顯著性非常高，即模型是有意義的。模型缺失項(xiàng)為0.049，說明所擬合回歸方程與實(shí)際情況吻合較好，模型能較好地反映南五味子中五味子甲素的實(shí)際試驗(yàn)值，即該模型可用于南五味子甲素含量的分析和預(yù)測與最佳提取工藝的確定。

表3 回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

注：* 表示不顯著；** 表示顯著；***表示極顯著。

由表4可知，相關(guān)系數(shù)R2=0.9987，說明該回歸模型不能解釋0.13%左右的變異，可以解釋99.87%的響應(yīng)值變化。因此該模型與實(shí)際情況吻合較好；C.V(變異系數(shù))=0.846%，表明回歸模型能很好反映實(shí)際的實(shí)驗(yàn)值，南五味子中五味子甲素的優(yōu)化提取工藝可以通過該方程來確定。

表4 回歸模型方差分析

2.2.3 響應(yīng)面分析 由圖6可知，當(dāng)提取溫度一定時，南五味子甲素得率隨提取時間延長而增大，當(dāng)提取時間在2.1～2.3 h時，南五味子甲素得率達(dá)到最大，若提取時間繼續(xù)延長，南五味子甲素的得率又呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢；當(dāng)提取時間一定時，提取溫度在85～90℃時，南五味子甲素得率最高。因此，適當(dāng)?shù)奶崛囟群吞崛r間對獲得較高的五味子甲素得率具有重要意義。

由圖7可知，當(dāng)提取溫度一定時，乙醇體積分?jǐn)?shù)在85%左右南五味子甲素得率最高；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)一定時，可得到較高南五味子甲素得率的提取溫度為85～90℃，之后南五味子甲素得率會隨提取溫度的升高而降低。由此可知，適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度對獲得的南五味子甲素得率也比較重要。

由圖8可知，當(dāng)提取時間一定時，獲得較高南五味子甲素的乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%～90%；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)一定，提取時間在1.9～2.3 h時，南五味子甲素得率最高。因此可知，在進(jìn)行試驗(yàn)的水平范圍內(nèi)，適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)在合適的提取時間下可獲得較高的南五味子甲素得率。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過回歸模型預(yù)測得出南五味子甲素提取最佳工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)85.07%，溫度87.68℃，時間2.12 h，即得到3.591 mg·g-1預(yù)測響應(yīng)值。綜合考慮優(yōu)化工藝和操作可行性，選擇驗(yàn)證試驗(yàn)的條件：料液比1∶10、提取溫度88℃、85%的乙醇熱提2.0 h，得出與理論值的偏差僅為0.064 mg·g-1的響應(yīng)值3.527 mg·g-1。

2.3 大孔樹脂初步分離純化結(jié)果與分析

表5 AB-8型大孔樹脂分離純化南五味子甲素結(jié)果

大孔樹脂是利用其多孔結(jié)構(gòu)與有機(jī)聚合物形成氫鍵，并借助范德華力選擇性吸附不同大分子，以達(dá)到分離純化有效成分的吸附材料[22]。筆者研究選擇極性弱的AB-8型大孔樹脂，由表5分析可知南五味子中的五味子甲素經(jīng)AB-8型大孔樹脂分離純化后，其純度比純化前提高了30.98%。

2.4 抑菌試驗(yàn)及最低抑菌濃度的測定結(jié)果與分析

2.4.1 初步分離純化前后抑菌活性對比 由表6分析可知，商洛南五味子甲素對四種供試菌均有抑制作用，且南五味子甲素經(jīng)AB-8型大孔樹脂分離純化后，抑菌能力明顯提高，抑菌效果優(yōu)于分離純化前。

2.4.2 抑菌試驗(yàn)結(jié)果與分析 由表7分析可知，南五味子甲素對枯草芽孢桿菌抑制效果最好，抑菌圈大小最高達(dá)21.4 mm，其次為金黃色葡萄球菌和大腸埃希式菌，最后是變形桿菌。并且濃度越小，在一定范圍內(nèi)，抑菌圈直徑越小，抑菌效果也越低。

表6 南五味子甲素初步分離純化前后抑菌活性對比結(jié)果

注:—表示無法測出抑菌圈直徑(即無抑菌活性)。

表7 南五味子甲素對四種供試菌種的抑菌結(jié)果

2.5 復(fù)合防腐保鮮液對香蕉保鮮的試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 不同處理對香蕉果實(shí)爛果率變化分析 圖9表明，香蕉果實(shí)的爛果程度隨著貯藏時間延長而增加，南五味子甲素具有抑菌、抗氧化等活性，在一定程度上抑制了香蕉在后熟期的腐敗變質(zhì)，因此香蕉果實(shí)經(jīng)南五味子甲素復(fù)合防腐保鮮液(處理C)涂膜處理后在貯藏過程中出現(xiàn)爛果率最低的趨勢，至貯藏7 d時，爛果率為74.47%。

2.5.2 不同處理對香蕉果實(shí)失重率變化分析 圖10表明，隨貯藏時間延長，各個不同處理的香蕉果實(shí)重量都有損失，但經(jīng)防腐保鮮涂膜處理的損失較少；在貯藏前4 d，最明顯的是南五味子甲素復(fù)合防腐保鮮液(處理C)的保鮮作用，這個處理在貯藏7 d的失重率只有7.49%，比空白對照組的9.31%明顯低。

2.5.3 不同處理對香蕉果實(shí)硬度變化分析 圖11表明，在貯藏過程中，香蕉果實(shí)硬度持續(xù)下降，貯藏最初變化不明顯，后期下降速率則比較快。在貯藏7 d時，五味子甲素復(fù)合防腐保鮮液(處理C)的作用效果最為明顯，香蕉果實(shí)硬度高達(dá)6.35 kg·cm-2，對照組的硬度低至2.24 kg·cm-2，基本失去了食用價值。

2.5.4 不同處理對香蕉果實(shí)pH值變化分析 圖12表明，貯藏時間越長，處理組和空白對照組香蕉果實(shí)的pH值均會有明顯的上升趨勢；同期相比可知，在一定程度上防腐保鮮涂膜層阻礙了香蕉果實(shí)的呼吸作用，從而抑制了酸堿值的改變速率，南五味子甲素復(fù)合防腐保鮮液(處理C)的pH值上升速率最慢，7 d時為5.54，空白對照組的pH值則上升最快，為5.63。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

(1)選擇單因素和響應(yīng)試驗(yàn)研究得出商洛南五味子甲素優(yōu)化提取方案：料液比1∶10、提取溫度88℃、85%的乙醇熱提2.0 h，南五味子甲素得率為3.527 mg·g-1。

(2)商洛南五味子甲素對供試菌種均有一定的抑菌效果，但經(jīng)過AB-8大孔樹脂純化后的抑菌效果更好，抑菌效果順序：變形桿菌<大腸桿菌<金黃色葡萄球菌<枯草芽孢桿菌。在一定濃度梯度內(nèi)，濃度越低，抑菌圈直徑越小，抑菌效果也越弱。

(3)新鮮后熟期香蕉經(jīng)制備的復(fù)合防腐保鮮液處理后，爛果率、pH值、硬度、失重率等檢測指標(biāo)比空白對照組的貯藏保鮮效果強(qiáng)。不同配比的防腐保鮮液對香蕉均具有明顯的保鮮效果，0.15%防腐保鮮液能夠延長后熟期香蕉的貯藏時間，且與殼聚糖復(fù)配后貯藏效果更佳，能有效延長市售香蕉的保藏時間，從而提高香蕉的食用品質(zhì)與食用價值。筆者試驗(yàn)?zāi)M新鮮后熟期香蕉最易腐敗變質(zhì)的溫度和濕度，日常的保藏條件優(yōu)于試驗(yàn)條件，因此在實(shí)際生活中保藏時間將長于筆者試驗(yàn)的保藏時間。

3.2 討論

(1)研究采用響應(yīng)面優(yōu)化乙醇熱浸法提取南五味子中五味子甲素，與其他溶劑提取法相比其工藝操作簡單，適宜于批量化處理，可節(jié)約成本，有利于資源的充分利用。實(shí)驗(yàn)所得南五味子中五味子甲素得率低于理論存在值，原因一是采摘時恰逢雨季，延誤了最佳采收時期，由于過熟而導(dǎo)致有效成分損失；原因二是提取工藝有待進(jìn)一步優(yōu)化，有研究表明乙醇回流法和超臨界CO2萃取所得的南五味子甲素的得率均高于乙醇熱提法[23]。

(2)研究是在實(shí)驗(yàn)室條件下所取得的有關(guān)南五味子甲素提取的工藝參數(shù)，鑒于實(shí)驗(yàn)時間、條件所限，只是對五味子甲素提取液用AB-8型大孔樹脂進(jìn)行了初步純化，仍含有部分雜質(zhì)。商洛南五味子甲素提取物對四種標(biāo)準(zhǔn)供試菌的生長均有一定抑制作用，但與提純效果較高的相關(guān)試驗(yàn)存在一定偏差[24]。因此，南五味子甲素最優(yōu)的分離提純方法，最佳的抑菌濃度等，還有待進(jìn)一步研究討論。

(3)南五味子作為商洛市重點(diǎn)發(fā)展的“五大商藥”之一，亟待多方面的開發(fā)利用。南五味子甲素能有效抑制常見腐敗菌及致病菌在環(huán)境中的繁殖生長，從而使食品的保質(zhì)期得到延長，可作為天然防腐劑在食品的保鮮中加以應(yīng)用。筆者研究首次利用南五味子甲素復(fù)配成防腐保鮮液并用于香蕉防腐保鮮，今后可進(jìn)一步研究南五味子甲素對霉菌及真菌的抑菌性能、作用機(jī)制等，以便更好地為商洛南五味子用于天然食品保鮮劑的研發(fā)提供參考依據(jù)。