朱健偉 駱 丹

1浙江醫(yī)院皮膚科，浙江杭州，310013；2南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，江蘇南京，210029

正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)能低水平表達(dá)CD40、CD54以及MHC-II等重要的表面抗原，其中以CD40的炎癥介導(dǎo)作用較為突出[1,2]。在皮膚炎癥(如銀屑病、特應(yīng)性皮炎等)病理?xiàng)l件下，KC表面的CD40分子能被多種炎癥因子如IFN-γ、IL-6、TNF-α等不同程度地上調(diào)，并與其趨化到表皮的T細(xì)胞表面的天然配體gp39相作用，加強(qiáng)KC炎癥介質(zhì)如IL-8、RANTES、MCP-1的釋放和表面抗原CD54等的表達(dá)，進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，即所謂的CD40/gp39途徑[2]。以銀屑病為例，CD40在銀屑病皮損中顯著表達(dá)，伴大量T細(xì)胞浸潤(rùn)，用CTLA4 Ig阻斷T細(xì)胞的共刺激能逆轉(zhuǎn)銀屑病皮損中KC和內(nèi)皮細(xì)胞的病理狀態(tài)，使病情得到臨床改善，并在連續(xù)性標(biāo)本中見(jiàn)到CD40等表面抗原的表達(dá)顯著下降[2,3]。此外，KC尚能自分泌具有較強(qiáng)免疫抑制作用的神經(jīng)肽α-MSH，而UVB能誘導(dǎo)KC分泌α-MSH[4]。為進(jìn)一步明確CD40是否參與介導(dǎo)KC的炎癥反應(yīng)，部分闡明UVB治療炎癥性皮膚病的可能機(jī)制，本研究以IFN-γ刺激KC，模擬炎癥狀態(tài)下KC的微環(huán)境，觀察UVB對(duì)該環(huán)境下KC形態(tài)、活性、表面抗原CD40、CD54、MHC-II及炎癥因子IL-8、IL-6、TNF-α表達(dá)的影響，并探討UVB對(duì)KC產(chǎn)生α-MSH的時(shí)效性影響。

1 材料和方法

1.1 材料 二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶、分離酶、臺(tái)式UVB照射儀均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。角質(zhì)形成細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(KC-SFM)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。25 cm2塑料培養(yǎng)瓶、6孔和96孔培養(yǎng)板為美國(guó)Corning公司產(chǎn)品。噻唑藍(lán)(MTT)為美國(guó)Amersco公司產(chǎn)品。FITC標(biāo)記鼠抗人CD40、CD54、MHC-II等抗體、IL-8、IL-6和TNF-α ELISA試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司。α-MSH放免試劑盒購(gòu)自瑞典Euro-Diagostica公司。重組人IFN-γ和可溶性CD40配體(sCD40L)均購(gòu)自英國(guó)Peprotech公司。Clinibio128c酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀系澳大利亞Clinibio公司產(chǎn)品。FACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。DFM-96型16管放免γ計(jì)數(shù)器為眾成公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取環(huán)切術(shù)后正常青少年包皮1塊，碘伏浸泡5 min后PBS清洗，剪除皮下組織，然后把皮片剪成1 cm2的皮片置入含0.5%分離酶的PBS中4℃消化12～16 h，眼科剪小心分離表皮，采用0.25%胰酶(含EDTA 0.53 mmol/L)37℃消化表皮5～10 min，吸去胰酶，加入含10%小牛血清培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打，離心1000轉(zhuǎn)10 min后棄上清，再用培養(yǎng)基吹懸細(xì)胞，以1×106個(gè)/cm2細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)基為含50 mg/L BPE、5 μg/L EGF、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的角質(zhì)形成細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(KC-SFM)，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)20 h后更換新鮮培養(yǎng)基，去除未貼壁細(xì)胞。以后每3天換液1次，細(xì)胞傳至3代用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 我們用多個(gè)濃度的IFN-γ(50, 100, 200, 300, 500, 1000 IU/mL)處理KC，并在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察和標(biāo)本收集，發(fā)現(xiàn)300 IU/mL的IFN-γ對(duì)KC的刺激作用較強(qiáng)，且無(wú)明顯毒性，在作用72 h后刺激作用最佳；更高濃度的IFN-γ則對(duì)KC產(chǎn)生明顯毒性，表現(xiàn)為增殖抑制，細(xì)胞凋亡增加。因此，我們選擇了300 IU/mL的IFN-γ作為最終實(shí)驗(yàn)濃度。然后，將細(xì)胞以105個(gè)/cm2的密度接種于6孔板，待其生長(zhǎng)貼壁并融合至80%后，分為空白組、300 IU/mL IFN-γ 處理72 h組、300 IU/mL IFN-γ處理72 h后再加100 ng/mL sCD40L孵育48 h組3組，每組重復(fù)3次，IFN-γ和sCD40L劑量及處理時(shí)間的設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[5]。然后在以上分組的基礎(chǔ)上再分設(shè)照光組和非照光組，照光組以30 mJ/cm2的生理劑量UVB進(jìn)行照射，以模擬表皮對(duì)UVB的反應(yīng)[6]。第3組的照光組在照光結(jié)束24 h后再加入sCD40L孵育。

1.2.3 KC的形態(tài)學(xué)觀察 用倒置光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯，CH型)觀察IFN-γ處理72 h前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，以及IFN-γ處理后再用30 mJ/cm2UVB照射后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變。

1.2.4 細(xì)胞活性的測(cè)定 采用MTT法，將細(xì)胞按空白組、300 IU/mL IFN-γ處理72 h組、30 mJ/cm2UVB組、300 IU/mL IFN-γ 處理72 h+30 mJ/cm2UVB組接種于96孔板，第3、4兩組均在照光后24 h進(jìn)行測(cè)定。每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，按上述分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，然后每孔(含100 mL培養(yǎng)基)加入20 mL濃度為5 mg/mL的MTT，孵育4 h，棄去上清，加入等量二甲基亞砜(DMSO)溶解，室溫下振蕩15 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔在490 nm處吸光值(A值)。

1.2.5 KC表面抗原的測(cè)定 用0.25%胰酶消化和收集未照光及照光24、48、72 h后的細(xì)胞于1 mL的EP管中，用PBS洗滌2次，離心棄上清液，每管加入FITC標(biāo)記的CD40單抗10 μL，重復(fù)的兩組細(xì)胞分別加入CD54和MHC-II單抗各10 μL，常溫避光作用20 min，然后再用PBS洗滌3次，離心后加入250 μL含1.5%多聚甲醛的PBS，4℃固定15 min，混勻后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定。加有sCD40L孵育的各組只測(cè)CD54和MHC-II。

1.2.6 上清液中α-MSH濃度的測(cè)定 采用放射免疫法(RIA)，樣本不與ACTH、β-MSH及γ-MSH交叉。樣本分空白組、300 IU/mL IFN-γ組及30 mJ/cm2UVB等3組，分別在0、24、48、72和96 h提取上清。檢測(cè)時(shí)，首先配備α-MSH標(biāo)準(zhǔn)品，濃度按說(shuō)明書(shū)。吸取各濃度標(biāo)準(zhǔn)品、樣本及對(duì)照各100 μL加入塑料離心管(NSB管的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0)，然后加200 μL抗α-MSH抗體于所有管中(NSB和TOT管除外)，同時(shí)加200 μL稀釋液于NSB管中，旋渦混合后4℃存放24 h。各管加入200 μL 125I-α-MSH，再次旋渦混勻后4℃存放24 h。加500 μL的二抗-PEG于除TOT管的所有管中，旋渦后4℃反應(yīng)45 min，離心棄上清，在γ臺(tái)檢測(cè)沉淀物的放射活性。

1.2.7 上清液中IL-6、IL-8、TNF-α濃度的測(cè)定 收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清液，按照ELISA說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作，測(cè)定上清液中IL-6、IL-8、TNF-α的含量。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析。

2 結(jié)果

2.1 KC的形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞呈鵝卵石狀，表面光滑，少數(shù)細(xì)胞可見(jiàn)微小突起。IFN-γ處理72 h后，細(xì)胞密度增高，大部分細(xì)胞表面可出現(xiàn)微小突起。棄去含IFN-γ的培養(yǎng)基，再用30 mJ/cm2UVB處理該細(xì)胞24 h后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞逐漸恢復(fù)初始形態(tài)，細(xì)胞密度降低(圖1)。

圖11a:為正常人角質(zhì)形成細(xì)胞形態(tài)；1b:為IFN-γ刺激72 h后的角質(zhì)形成細(xì)胞形態(tài)；1c:為IFN-γ刺激72 h后再用30 mJ/cm2UVB處理24 h后的角質(zhì)形成細(xì)胞形態(tài)

2.2 MTT測(cè)定結(jié)果 單用IFN-γ處理KC 72 h后，其活性較對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P<0.05)；30 mJ/cm2UVB處理細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活性較空白對(duì)照組略低；而IFN-γ處理72 h再用UVB處理細(xì)胞24 h后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活性急劇下降，A值從4.02降至1.31，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 各處理組的角質(zhì)形成細(xì)胞活性(MTT法)

2.3 KC表面抗原測(cè)定結(jié)果 各處理組KC表面抗原的表達(dá)情況見(jiàn)表1。對(duì)照組細(xì)胞CD40的表達(dá)率為(7.68±2.14)%，即KC表面有少量CD40的表達(dá)。經(jīng)IFN-γ刺激72 h后，其表達(dá)率顯著提高(P<0.01)，為(91.36±2.92)%。IFN-γ刺激后的細(xì)胞再經(jīng)30 mJ/cm2UVB照射后，其CD40表達(dá)率逐漸下降(圖3a)，至72 h為(30.84±3.36)%。另外，同時(shí)可測(cè)得正常細(xì)胞CD54表達(dá)率為(4.45±0.61)%，IFN-γ刺激72 h后其表達(dá)率為(12.07±0.87)%,當(dāng)IFN-γ刺激72 h再加入sCD40L后，CD54的表達(dá)率進(jìn)一步增高，為(80.47±6.11)%，而IFN-γ刺激72 h后的細(xì)胞加用30 mJ/cm2UVB處理24 h后，再加sCD40L孵育48 h，發(fā)現(xiàn)CD54的表達(dá)率雖仍高于對(duì)照組和未經(jīng)sCD40L配基化的IFN-γ處理組，但較未照光的IFN-γ處理組大為下降(圖3b)。加入sCD40L后，細(xì)胞表面CD54的表達(dá)上調(diào)具有CD40特異性，它能被sCD40L特異性抗體所阻斷。IFN-γ還能上調(diào)KC表面MHC-II分子的表達(dá)，UVB亦能下調(diào)IFN-γ誘導(dǎo)的MHC-II分子的表達(dá)，但加入sCD40L后其表達(dá)無(wú)明顯變化。

表1 各處理組KC 3種表面分子的表達(dá)情況

注:N表示未檢測(cè)。與對(duì)照組相比, 1)P<0.01;2)P<0.05。涉及UVB組均在照射后72 h后檢測(cè)

2.4 上清液中α-MSH測(cè)定結(jié)果 各組上清液中α-MSH的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4。可見(jiàn)，KC能低水平分泌α-MSH，經(jīng)UVB照射后，其分泌量在24 h內(nèi)升高，48 h時(shí)差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，72 h達(dá)高峰(P<0.01)，96 h后驟降為基礎(chǔ)水平。IFN-γ不影響α-MSH的表達(dá)(P>0.05)。

2.5 上清液中細(xì)胞因子測(cè)定結(jié)果 IFN-γ刺激后的KC與sCD40L孵育48 h后，IL-8的釋放量最高(P<0.01)。而IFN-γ刺激后的KC用UVB照射后再與sCD40L孵育，IL-8的分泌量大為下降(P<0.05)。而TNF-α、IL-6的濃度無(wú)明顯變化(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各處理組KC IL-8、TNF-α及IL-6的分泌情況

注:與對(duì)照組相比, 1)P<0.01;2)P<0.05。涉及UVB組均在照射后72 h后檢測(cè)

圖3各處理組細(xì)胞表面CD40、CD54的流式測(cè)定結(jié)果 3a：峰1示對(duì)照組CD40表達(dá),峰2示IFN-γ處理72 h后的CD40表達(dá)，峰3示IFN-γ處理后再用30 mJ/cm2UVB 照射后72 h的CD40表達(dá)；3b：峰1示對(duì)照組CD54表達(dá)，峰2示IFN-γ 72 h+sCD40L 48 h 后的CD54 表達(dá)，峰3示IFN-γ 72 h+UVB 24 h+sCD40L 48 h后的CD54表達(dá)圖4各處理組α-MSH濃度變化

3 討論

在多種免疫性皮膚病，T細(xì)胞和KC處于激活狀態(tài)。激活狀態(tài)下的KC表面CD40分子和T細(xì)胞表面的gp39相結(jié)合被認(rèn)為參與了這類皮膚病的發(fā)病。Pasch等[2]采用免疫組化檢測(cè)了銀屑病患者皮損和非皮損部位CD40和gp39的分布。結(jié)果顯示，皮損和非皮損部位均有CD40+的KC集落。在皮損處可見(jiàn)大量T細(xì)胞，gp39+T細(xì)胞可見(jiàn)于70%的皮損中，而在非皮損部位，gp39+T細(xì)胞只占20%。他們還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)IFN-γ處理的KC能釋放少量IL-8、RANTES及MCP-1，用可溶性gp39與CD40結(jié)合后能大大加強(qiáng)其釋放。在特應(yīng)性皮炎患者，樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)表面的CD40配體很可能就是與KC表面的CD40相結(jié)合，致使炎癥的持續(xù)發(fā)生[7,8]。在接觸性超敏反應(yīng)中，KC表面CD40分子的專一性結(jié)合加劇和延長(zhǎng)了皮膚免疫反應(yīng)，CD40分子能在體內(nèi)放大皮膚和區(qū)域T細(xì)胞應(yīng)答[9]。以上均說(shuō)明CD40/gp39是炎癥啟動(dòng)的重要途徑。

本研究證實(shí)，正常人KC能低水平表達(dá)CD40、CD54、MHC-II分子，IFN-γ能增強(qiáng)KC的活性，并加強(qiáng)其表面這3種抗原的表達(dá)，30 mJ/cm2UVB照射對(duì)NHK的形態(tài)、活性及其表面抗原的表達(dá)無(wú)明顯影響，但能抑制IFN-γ誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和活性的增強(qiáng)及其表面抗原的過(guò)表達(dá)，該抑制效應(yīng)在照射后72 h達(dá)高峰。我們還發(fā)現(xiàn)，CD54的表達(dá)確實(shí)具有CD40特異性，因?yàn)榧尤雜CD40L孵育后，CD54的表達(dá)進(jìn)一步升高，而MHC-II沒(méi)有出現(xiàn)這一情況，這說(shuō)明CD54的過(guò)表達(dá)主要是通過(guò)CD40/gp39途徑所介導(dǎo)。此外，我們定量測(cè)得UVB照射能促進(jìn)KC自分泌產(chǎn)生一種具有免疫抑制作用的神經(jīng)肽α-MSH，其分泌具有一定時(shí)間依賴，在UVB照后24 h開(kāi)始升高，72 h達(dá)高峰，96 h驟降為基礎(chǔ)水平。細(xì)察可發(fā)現(xiàn)，α-MSH分泌水平與細(xì)胞表面CD40表達(dá)率剛好呈相反趨勢(shì)，在UVB照后72 h，α-MSH分泌量達(dá)高峰的同時(shí)，細(xì)胞表面CD40的表達(dá)率達(dá)最低。因此，我們推測(cè)UVB很可能是通過(guò)誘導(dǎo)KC產(chǎn)生α-MSH，間接地下調(diào)了炎癥因子誘導(dǎo)的細(xì)胞表面CD40等分子的表達(dá)，從而干預(yù)了CD40/gp39途徑對(duì)炎癥的啟動(dòng)。另外，表1、2的結(jié)果還證實(shí)CD54的高表達(dá)及IL-8的大量釋放促使了炎癥反應(yīng)的持續(xù)發(fā)生，這種情況至少部分由CD40/gp39途徑啟動(dòng)，因此，只要細(xì)胞處于CD40/gp39激活狀態(tài)，UVB就能抑制該途徑而降低皮損中CD54和IL-8的表達(dá)水平。此外，UVB能加強(qiáng)KC IL-8的產(chǎn)生，其實(shí)這種產(chǎn)量與前者相比是微乎其微而且是暫時(shí)性的。

總之，在一些免疫性皮膚病的炎癥反應(yīng)中，多種炎癥細(xì)胞因子(如IL、IFN、TNF等)能上調(diào)KC表面CD40的表達(dá)，同時(shí)趨化T細(xì)胞和DCs聚集并使其表達(dá)CD40配體即gp39，致使CD40/gp39相互作用，引起一系列免疫應(yīng)答。UVB照射能下調(diào)炎癥細(xì)胞因子誘導(dǎo)的CD40的表達(dá)，是CD40/gp39途徑的一項(xiàng)重要干預(yù)手段。