劉宇甄 曾 榮 徐浩翔 段志敏 林 彤 李 岷

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院，南京，210042；2江蘇省皮膚性病學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南京,210042

痤瘡是皮膚科最常見的感染性、炎癥性皮膚病之一。痤瘡丙酸桿菌是其重要的發(fā)病環(huán)節(jié)。微生物感染常大多合并生物膜的形成。這在痤瘡患者皮損中也得到了印證。生物膜一旦形成，不僅致病性增加，其對(duì)抗菌藥物的耐藥性也增加[1]。因此針對(duì)痤瘡丙酸桿菌生物膜的研究是十分重要的。齊顯龍等[2]報(bào)道了使用掃描電鏡觀察痤瘡丙酸桿菌生物膜構(gòu)建6天的研究，發(fā)現(xiàn)第4天是生物膜的形成最佳時(shí)間。然而掃描電鏡在觀察生物膜時(shí)存在制片時(shí)會(huì)破壞生物膜結(jié)構(gòu)，且僅能觀察到生物膜表面結(jié)構(gòu)，無法觀察生物膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)等缺陷，從而在微生物生物膜研究領(lǐng)域逐步被有著“顯微CT”之稱的激光共聚焦顯微鏡取代。另外完整的生物膜形成過程包含生物膜的黏附、聚集、成熟和播散等四個(gè)重要過程。而目前針對(duì)痤瘡丙酸桿菌生物膜成膜規(guī)律的研究尚未見報(bào)道。我們的初步預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這個(gè)過程大概有20天。因此本研究將使用激光共聚焦顯微鏡持續(xù)20天動(dòng)態(tài)觀察痤瘡丙酸桿菌生物膜形成及再形成的過程，并對(duì)其進(jìn)行四甲基氮鹽[2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide inner salt, XTT]細(xì)胞活力測定，明確其最佳的成膜時(shí)間，為進(jìn)一步的痤瘡丙酸桿菌生物膜研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 痤瘡丙酸桿菌(ATCC 11827)購自美國生物標(biāo)準(zhǔn)品資源中心；腦心浸液培養(yǎng)基(Brain-Heart Infusion Broth，BHI)購自英國Oxiod公司；live/DeadTMbacklightTM bacterial viability kit 購自美國ThermoFisher scientific公司； XTT購自美國(Sigma公司；激光共聚焦顯微鏡購自日本奧林巴斯公司(Olympus-FV1000)；酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；厭氧培養(yǎng)裝置(加拿大STEMCELL Technologies公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備 將冰凍菌株P(guān).acne常溫化凍后接種于腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基表面，置于厭氧培養(yǎng)裝置中37℃培養(yǎng)。48 h后挑取單個(gè)菌落至50 mL BHI肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行厭氧37℃振蕩培養(yǎng)48 h。振蕩后依據(jù)麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)整菌懸液濃度為1×108CFUs/mL備用。

1.2.2 生物膜構(gòu)建 生物膜的體外構(gòu)建方法參考Capoor等[3]的生物膜的構(gòu)建法。本研究將構(gòu)建24孔板生物膜用于激光共聚焦顯微鏡觀察研究。另外構(gòu)建96孔板生物膜用于XTT細(xì)胞活力測定法研究。構(gòu)建過程大致如下：在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板需要提前放置無菌細(xì)胞爬片。將預(yù)先制備的濃度為1×108CFUs/mL BHI培養(yǎng)基菌懸液吸取1 mL至其中。在厭氧培養(yǎng)裝進(jìn)行37℃培養(yǎng)。期間新鮮BHI液體培養(yǎng)基每一至兩日更換一次。持續(xù)孵育，在預(yù)設(shè)的不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)生物膜進(jìn)行測定。96孔板生物膜的過程基本同24孔板，但無需提前放置細(xì)胞爬片。

1.2.3 激光共聚焦顯微鏡 對(duì)生物膜結(jié)構(gòu)及厚度測定在預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)痤瘡丙酸桿菌生物膜進(jìn)行染色處理。使用LIVE/DEADTMBacLightTMBacterial Viability Kit進(jìn)行染色觀察。該染料含有SYTO9(1.67 mM)和PI(1.67 mM)兩種熒光染料。前者可以被活菌吸收，在480 nm激光作用下可使活菌顯示綠色熒光。后者可以被細(xì)菌的DNA或細(xì)胞外基質(zhì)成分吸收，在635 nm激光作用下使上述成分顯示紅色熒光。在預(yù)設(shè)的時(shí)間點(diǎn)取出24孔板中細(xì)胞爬片，加入200 μL 上述染料混合液，厭氧培養(yǎng)37℃孵育30 min，后使用激光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行觀察。使用激光共聚焦顯微鏡自帶軟件(Olympus fluo view 3.1 viewer)對(duì)生物膜進(jìn)行三維立體結(jié)構(gòu)重建。

1.2.4 XTT法活力測定 XTT用于測定生物膜活體部分的代謝活力，以此評(píng)價(jià)生物膜的活力，生物膜的生長情況。在預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)測量生物膜活力。大致步驟如下：取出含有生物膜的96孔板，先吸棄上清，使用1×PBS清洗生物膜表面3遍。然后每孔加入100 μL XTT(0.5 mg/mL)/Vit.K3(10 mM)混合液。鋁箔紙包扎避光，厭氧培養(yǎng)裝置中37℃培養(yǎng)3 h。然后吸取上述孔中50 μL上清至酶標(biāo)儀板中使用490 nm波長光源測定分光光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次以上。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差) 表示。

2 結(jié)果

2.1 痤瘡丙酸桿菌生物膜結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)觀察 生物膜結(jié)構(gòu)形成的動(dòng)態(tài)過程如圖1所示。1～3天菌體細(xì)胞黏附于載體表面，數(shù)量逐漸增多，并初步相互融合，形成微菌落；4～6天出現(xiàn)黃色熒光，表明開始分泌細(xì)胞外基質(zhì)開始逐步形成，且微菌落逐漸融合，生物膜厚度逐漸增加，從而使生物膜三維立體結(jié)構(gòu)逐步形成；7～8天生物膜出現(xiàn)大量黃色熒光，表明菌體產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)膜，生物膜結(jié)構(gòu)進(jìn)一步成熟，產(chǎn)生眾多黑暗的管道系統(tǒng)分隔，形態(tài)多樣、縱橫交錯(cuò)的孔道貫穿生物膜全層，且在第8天生物膜的厚度為(29.8±2.167)μm；9～10天生物膜菌體開始出現(xiàn)播散，生物膜結(jié)構(gòu)部分破碎，厚度下降；15天生物膜三維立體結(jié)構(gòu)破壞，活菌細(xì)胞呈單個(gè)游離分布，圖片以紅色熒光為主，表明菌體細(xì)胞大量死亡，反映生物膜結(jié)構(gòu)完全崩解；在第20天部分活菌細(xì)胞再次黏附于載體表面，形成新的微菌落群，開始新的一輪生物膜構(gòu)建。

2.2 痤瘡丙酸桿菌生物膜的厚度變化動(dòng)態(tài)觀察 生物膜厚度的動(dòng)態(tài)變化過程如圖2所示。生物膜構(gòu)建過程中在菌懸液培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7、8、10、15和20天的厚度分別為0 μm、(4.8±0.867)μm、(9.6±1.156)μm、(14.0±3.391)μm、(18.1±2.588)μm、(20.2±1.33)μm、(24.2±1.643)μm、(29.8±2.167)μm、(28.2±2.387)μm、(21.8±1.789)μm、(20.2±1.303)μm和(11.2±1.483)μm。上述結(jié)果顯示在1～8天生物膜厚度逐漸增加，到第8天達(dá)最高峰，第9～20天生物膜厚度逐漸下降。

2.3 痤瘡丙酸桿菌生物膜活力動(dòng)態(tài)變化 生物膜活力動(dòng)態(tài)變化過程如圖3所示。生物膜在構(gòu)建過程中在菌懸液培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7、8、10、15和20天后的XTT法活力測定值分別為0.089±0.014、0.104±0.018、0.158±0.029、0.217±0.044、0.280±0.022、0.319±0.059、0.433±0.048、0.620±0.063、0.421±0.056、0.352±0.157、0.241±0.036和0.155±0.038。上述結(jié)果顯示在1～8天生物膜的活力逐漸增加，到第8天生物膜活力值達(dá)到最佳狀態(tài)，后在第9～20天后活力逐漸下降。

圖1使用激光共聚焦顯微鏡連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察痤瘡丙酸桿菌生物膜的成膜規(guī)律(圖中橫線表示50 μm)：A1～A12分別表示培養(yǎng)0、1、2、3、4、5、6、7、8、10、15和20 d的生物膜平面圖；B1～B12分別表示培養(yǎng)0、1、2、3、4、5、6、7、8、10、15和20 d的生物膜3D立體結(jié)構(gòu)圖

圖2 生物膜厚度的動(dòng)態(tài)測定

圖3 生物膜活力的動(dòng)態(tài)測定

3 討論

據(jù)報(bào)道，臨床微生物感染大約有60%存在生物膜的形成[4]。痤瘡丙酸桿菌生物膜形態(tài)在痤瘡患者的炎癥性丘疹和非炎癥丘疹中均有發(fā)現(xiàn)[5]。痤瘡丙酸桿菌生物膜形成后其對(duì)機(jī)體的致病性及對(duì)抗菌藥物的耐藥性顯著性增加[6]。因此，進(jìn)一步深入開展痤瘡丙酸桿菌生物膜的研究將有助于加深痤瘡丙酸桿菌對(duì)機(jī)體的致病作用及對(duì)抗菌藥物的耐藥機(jī)制認(rèn)識(shí)。目前針對(duì)痤瘡丙酸桿菌生物膜形成情況尚少，因此本研究將持續(xù)20天對(duì)痤瘡丙酸桿菌生物膜進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究，以期為針對(duì)痤瘡丙酸桿菌生物膜的研究奠定基礎(chǔ)。

細(xì)菌生物膜是一種不同于浮游(單個(gè))細(xì)胞的存在形式的三維結(jié)構(gòu)菌體細(xì)胞群。其主要結(jié)構(gòu)包括菌體及包裹菌體的胞外聚合物(主要為胞外多糖，蛋白質(zhì)、磷脂、水和胞外DNA等)[7]。目前研究生物膜形態(tài)和結(jié)構(gòu)的常用方法主要是各種顯微鏡技術(shù)，如掃描電鏡、熒光電鏡、激光共聚焦顯微鏡等[8，9]。電鏡技術(shù)雖然能夠放大足夠倍數(shù)來觀察生物膜的結(jié)構(gòu)。但是在制片過程中的試劑會(huì)將菌體殺滅，因此無法觀察到活菌狀態(tài)下生物膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。而激光共聚焦顯微鏡很好的解決了這一問題。當(dāng)生物膜進(jìn)行活體染色后，激光共聚焦顯微鏡不僅對(duì)熒光標(biāo)記的細(xì)胞或組織的某一層面獲取各種熒光的圖像，另外還能對(duì)一定厚度的生物膜進(jìn)行逐層掃描拍攝圖像，并經(jīng)過軟件分析能夠得到生物膜的三維立體結(jié)構(gòu)圖。因此，本研究采用了激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行痤瘡丙酸桿菌生物膜形成、播散和再形成的動(dòng)態(tài)觀察研究。

在測定細(xì)菌生物膜量及活力方面的常用方法主要是基于每種檢測方法與生物膜相互作用后的某種特定成分的分光光度值變化。常用的檢測方法有結(jié)晶紫染色法、四氮唑鹽減低法(MTT)和四甲基氮鹽法(XTT)[10,11]。其中XTT法因其操作精確、簡便、快速而得到了廣泛使用。本研究就采用了該方法對(duì)生物膜的活力進(jìn)行測定。

痤瘡丙酸桿菌生物膜最佳形成時(shí)間的確定是獲得成熟生物膜模型的重要指導(dǎo)。細(xì)菌生物膜的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，主要包括以下四個(gè)階段：1、黏附：菌體細(xì)胞黏附于載體表面；2、聚集：微菌落的形成；3、成熟：分泌細(xì)胞外基質(zhì)，微菌落融合成成熟生物膜；4、播散：菌體細(xì)胞和生物膜碎片播散形成新的生物膜[12]。我們的研究目的在于通過激光共聚焦顯微鏡檢測生物膜各個(gè)階段的結(jié)構(gòu)情況并利用XTT法檢測生物膜的活力情況來探索痤瘡丙酸桿菌生物膜構(gòu)建的整個(gè)過程及其最佳成膜時(shí)間。通過對(duì)生物膜進(jìn)行SYTO9/PI染色，觀察到痤瘡丙酸桿菌生物膜構(gòu)建過程也同樣經(jīng)歷了上述四個(gè)步驟。我們研究發(fā)現(xiàn)P.ance的生物膜成熟時(shí)間較長為8天，而表皮葡萄球菌為24 h[13,14]、金黃色葡萄球菌為24 h[15,16]、銅綠假單胞菌為72 h[17]。生物膜形成時(shí)間點(diǎn)差異可能與不同微生物的代謝速度不同相關(guān)。痤瘡丙酸桿菌生物膜相關(guān)研究中使用的生物膜培養(yǎng)的時(shí)間從48 h至120 h[18-20]。這些研究只是取了特定的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)生物膜進(jìn)行相關(guān)的耐藥性及致病性研究，未對(duì)生物膜進(jìn)行長時(shí)間的成膜規(guī)律探索。齊顯龍等[2]也在體外構(gòu)建了痤瘡丙酸桿菌生物膜模型，最長觀察時(shí)間為6天，使用的檢測方法為XTT法和掃描電鏡法，觀察到生物膜最佳成熟狀態(tài)時(shí)間是4天。我們的研究目的是探索痤瘡丙酸桿菌的成膜規(guī)律，包含生物膜的黏附、聚集、成熟和播散等四個(gè)重要過程，因此將觀察時(shí)間設(shè)定為20天。我們使用的檢測方法為XTT法和激光共聚焦顯微鏡。我們的研究也發(fā)現(xiàn)4天后已經(jīng)有了生物膜的三維立體結(jié)構(gòu)，但是生物膜的厚度、生物膜的細(xì)胞外基質(zhì)和生物膜的活力在第8天才能達(dá)到最佳狀態(tài)。這種差異可能與以下幾方面因素相關(guān)：1、菌種不同的差異；2、菌體細(xì)胞培養(yǎng)的載體有差異；3、觀察時(shí)間不一致：該研究最長的觀察時(shí)間是6天；4、選用的測量方法有差異：該研究使用掃描電鏡進(jìn)行觀察，雖然能夠?qū)⑸锬し糯蟮阶銐蚩梢钥辞宄谋稊?shù)，但是它的前期標(biāo)本固定會(huì)損傷生物膜活力及完整性，且只能觀察生物膜表面的情況，但是無法如同激光共聚焦顯微鏡那樣觀察生物膜形成過程中的厚度變化、熒光顏色變化、生物膜的三維立體結(jié)構(gòu)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化等。生物膜結(jié)構(gòu)是否成熟與生物膜的厚度、熒光顏色及三維立體結(jié)構(gòu)內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。我們研究觀察到在生物膜培養(yǎng)的第8天上述各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到最佳狀態(tài)。因此，我們認(rèn)為第8天是生物膜結(jié)構(gòu)最成熟、活力最高的階段。

痤瘡丙酸桿菌生物膜是痤瘡致病及對(duì)抗菌藥物耐藥的重要原因。我們通過激光共聚焦顯微鏡檢測法和XTT活力測定法動(dòng)態(tài)觀察了痤瘡丙酸桿菌形成生物膜從構(gòu)建、播散、再構(gòu)建的全過程，從中進(jìn)一步明確了生物膜結(jié)構(gòu)最成熟的時(shí)間是培養(yǎng)的第8天。上述研究結(jié)果將有助于研究人員開展痤瘡丙酸桿菌生物膜方面的深入研究，進(jìn)而將有利于進(jìn)一步闡明痤瘡丙酸桿菌生物膜的致病機(jī)制及其耐藥機(jī)制。