周怡，郭映純，方叢

（中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心，廣州 510655）

全球兒童和青少年腫瘤的發(fā)病率從1975年至2011年上升了42%，而死亡率下降了57%［1］。隨著腫瘤治療技術(shù)的進(jìn)步，兒童和青少年腫瘤患者的遠(yuǎn)期生存率不斷提高，白血病患兒5年生存率達(dá)到88%，其它腫瘤可達(dá)92%［2］。生育力受損是抗腫瘤治療常見的遠(yuǎn)期并發(fā)癥之一，在兒童和青少年期接受過放化療治療的患者成年后發(fā)生卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）和不孕的風(fēng)險增加，一部分患者因此而無法生育。這對于成年的腫瘤存活者及家庭來說，常會帶來巨大的精神心理壓力，嚴(yán)重降低生活質(zhì)量［3］。

美國臨床腫瘤學(xué)會（ASCO）指南建議，每位兒童和青少年患者在抗腫瘤治療前都應(yīng)進(jìn)行生育力保存咨詢。通過手術(shù)、藥物和輔助生殖技術(shù)保護(hù)患者的生育力，使其在成年后能生育遺傳學(xué)后代，已成為提高兒童和青少年腫瘤患者成年后生活質(zhì)量的重要措施［4］。女性生育力保存的方法主要有胚胎冷凍、卵子冷凍和卵巢組織冷凍（ovarian tissue cryopreservation，OTC），目前公認(rèn)的首選方案為胚胎／卵子冷凍［5］。對于兒童和青少年腫瘤患者而言，因未婚和部分患者生殖系統(tǒng)尚未發(fā)育，在制定生育力保存方案時需要綜合考慮生理和社會倫理多方面因素。本文將針對女性兒童和青少年腫瘤患者，闡述抗腫瘤治療對生育力的影響、生育力保存措施及研究進(jìn)展。

一、抗腫瘤治療對生育力的影響

在兒童或青少年期接受過放化療的女性，成年后POF的發(fā)生風(fēng)險是其同胞姐妹的10倍，懷孕和獲得活產(chǎn)的機(jī)率也減少［6］?？鼓[瘤治療的生殖毒性與患者年齡、化療藥物種類、藥物劑量、放療部位、放療劑量等多種因素相關(guān)［7－8］。

1．化療：烷化劑是常用化療藥物中對性腺毒性最大的一類，包括有環(huán)磷酰胺、白消安、甲基芐肼、氮芥等，通過與DNA發(fā)生交叉聯(lián)結(jié)，破壞DNA結(jié)構(gòu)產(chǎn)生細(xì)胞毒性。烷化劑屬于細(xì)胞周期非特異性藥物，對生長中和靜止期的卵泡均有毒性作用，大劑量的烷化劑（總環(huán)磷酰胺≥4 000mg／m2）導(dǎo)致女性發(fā)生不孕的概率超過80%［9］。Levine等［6］對2 930名兒童腫瘤幸存者生育力進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在兒童期甲基芐肼暴露劑量≥4 000mg／m2的成年幸存者發(fā)生POF的風(fēng)險是同胞姐妹的8．96倍，而且隨著烷化劑累計劑量的增加，成年后懷孕的機(jī)率下降［7］。紫杉醇、順鉑和蒽環(huán)類藥物（阿霉素、柔紅霉素）等藥物為中等性腺毒性，抗代謝藥物（甲氨蝶呤、阿糖胞苷、5－氟尿嘧啶）和長春堿類對性腺毒性極低［10］。

2．放療：卵母細(xì)胞對輻射損傷敏感，任何劑量的卵巢輻射都會增加POF的風(fēng)險，且其發(fā)生率呈劑量依賴性。追蹤兒童期腫瘤的成年幸存者，發(fā)現(xiàn)當(dāng)卵巢暴露的輻射劑量＜500cGy時，POF發(fā)生風(fēng)險是正常同胞姐妹的3倍，當(dāng)輻射劑量≥500cGy時，發(fā)生風(fēng)險增加至8倍［6］。大劑量（≥10Gy）的卵巢照射以及全身照射（total body irradiation，TBI）會導(dǎo)致急性卵巢衰竭，頭顱部的放療會損害下丘腦－垂體－卵巢性腺軸。卵巢或子宮曾暴露于5～10Gy的輻射，成年后妊娠的幾率減少至56%，如果＞10Gy則急劇減少至18%［7］?；颊吣挲g越小，卵巢對放療的耐受性越高，導(dǎo)致不孕的盆腔或全腹部放療劑量在出生時、10歲、20歲、30歲女性中分別為20．3Gy、18．4Gy、16．5Gy和14．3Gy［11］。放療還會損害子宮的內(nèi)膜、肌層和血管，增加自然流產(chǎn)、胎兒生長受限、妊娠期高血壓疾病、早產(chǎn)的發(fā)生風(fēng)險［10］。

3．兒童和青少年常見腫瘤治療后風(fēng)險：抗腫瘤治療方案常聯(lián)合使用多種化療藥物，有些還需同時進(jìn)行放／化療，因此不同患者的不同治療方案，導(dǎo)致不孕的風(fēng)險也不同。急性淋巴細(xì)胞白血病和淋巴瘤是兒童最常見的腫瘤，急性淋巴細(xì)胞白血病化療方案的性腺毒性低，淋巴瘤不同治療方案的性腺毒性不同?；羝娼鹆馨土鲋委熤泻型榛瘎┑姆桨?，如MVPP（氮芥，長春堿，甲基芐肼，潑尼松龍），COPP（環(huán)磷酰胺，長春新堿，甲基芐肼，潑尼松龍）和ChlVPP（苯丁酸氮芥，長春堿，甲基芐肼，潑尼松龍）方案對卵巢毒性大，治療后停經(jīng)的發(fā)生率為38%～57%，而ABVD方案（阿霉素，博來霉素，長春堿，氮烯唑胺）的性腺毒性明顯降低［9］。非霍奇金淋巴瘤治療后不孕的發(fā)生風(fēng)險可達(dá)44%［9］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤也是兒童和青少年常見腫瘤，頭顱放療為常用治療方案，35～45Gy的放療劑量會導(dǎo)致性腺功能減退。對于需要骨髓移植的患者，TBI或大劑量化療最終導(dǎo)致不孕的風(fēng)險大于80%［4］。Wallace等［11］根據(jù)兒童和青少年常見腫瘤和治療方案，對不同腫瘤治療后不孕不育的發(fā)生風(fēng)險進(jìn)行了等級劃分（表1）。

表1 兒童和青少年腫瘤治療后不孕不育的發(fā)生風(fēng)險［11］

二、生育力保存方法

對青春期后患者，卵子冷凍是目前公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)方案，而青春期前患者的主要方法是OTC。在臨床實踐中要根據(jù)每個患者的年齡、病情和個人意愿，綜合衡量利弊后做出最優(yōu)選擇。

1．卵子冷凍：對于青春期后的腫瘤患者，卵子冷凍是保存生育力的首選方法［12］。隨著卵子冷凍技術(shù)日趨成熟，2013年美國生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會（ASRM）提出成熟卵子冷凍技術(shù)應(yīng)作為一項成熟技術(shù)應(yīng)用于臨床工作［13］。現(xiàn)在每個冷凍卵子的臨床妊娠率為4%～12%，最終形成的每個移植胚胎妊娠率為36%～61%，與新鮮卵子和冷凍胚胎相比無統(tǒng)計學(xué)差異［14］。

卵子冷凍最好在放化療開始之前進(jìn)行，從控制性卵巢刺激（COS）開始到取卵冷凍至少需要2～3周，所以只適用于抗腫瘤治療可以推遲的患者。在COS過程中體內(nèi)雌激素處于超生理水平，這對雌激素敏感腫瘤（如乳腺癌）患者是否安全一直是臨床醫(yī)生的顧慮。對這部分患者可選擇聯(lián)合使用來曲唑或他莫昔芬的COS方案，在降低體內(nèi)雌激素水平的同時不影響胚胎質(zhì)量和妊娠率，對乳腺癌患者隨訪發(fā)現(xiàn)，也不會增加腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險和降低生存率［15－16］。

青春期前和不能耐受COS的患者，可從卵巢中穿刺抽取未成熟卵，經(jīng)過體外培養(yǎng)成熟（IVM）后冷凍保存。Abir等［17］從42名2～18歲要進(jìn)行OTC的腫瘤患者的卵巢中穿刺抽取未成熟卵，同時過濾進(jìn)行卵巢切片的液體，最終28例成功保存凍卵，年齡最小的是一名5歲白血病患兒。通過這種方法獲得冷凍卵子的數(shù)目與年齡呈正相關(guān)，年齡越大獲得凍卵數(shù)目越多。

2．OTC：對于青春期前患者，OTC是保存生育力的主要方法。OTC不需要2～3周的卵巢刺激，也適用于腫瘤治療無法推遲和不能耐受COS的患者［18］。OTC要通過手術(shù)切取部分卵巢組織或者單側(cè)卵巢，然后切割卵巢組織皮片冷凍保存。重新移植回去的卵巢組織能維持生殖內(nèi)分泌功能4到5年，最長可達(dá)7年，患者可以通過自然懷孕或輔助生殖技術(shù)獲得妊娠。自2000年世界第1例冷凍卵巢組織成功移植至今，已有超過130名嬰兒誕生［19］。根據(jù)最近的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，卵巢組織冷凍移植后的活產(chǎn)率可達(dá)到37．7%［20］。雖然目前報道的活產(chǎn)基本都來源于成年女性的冷凍卵巢組織，但對一些尚未進(jìn)入青春期患者再移植兒童和青少年期冷凍的卵巢組織后，可以引發(fā)第二性征發(fā)育及月經(jīng)來潮［18］。Demeestere等［21］報道了1位在14歲行OTC的鐮形紅細(xì)胞貧血患者，10年后移植回卵巢組織，最終自然懷孕誕下一名健康男嬰，這說明了OTC在兒童和青少年患者中的可行性。

3．促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH－a）卵巢抑制：GnRH－a與GnRH受體有高度親和力，持續(xù)使用或使用長效制劑，能下調(diào)垂體表面受體，內(nèi)源性促性腺激素分泌被抑制，從而達(dá)到藥物性垂體－卵巢抑制。處于靜止期的細(xì)胞對化療藥物敏感性降低，如果卵巢被抑制，理論上可以降低化療藥物的毒性作用。Blumenfeld等［22］回顧性對比分析了在化療中使用和未使用GnRH－a的腫瘤患者化療結(jié)束2年后的卵巢功能和妊娠情況，兩組POF的發(fā)生率分別為13%和51%，自發(fā)妊娠率分別為65．6%和37．9%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。對早期乳腺癌化療患者應(yīng)用GnRH－a卵巢抑制有利于化療后恢復(fù)正常月經(jīng)和減少早發(fā)性卵巢功能不全的發(fā)生風(fēng)險［23－24］。但一項前瞻性臨床隨機(jī)對照試驗示，淋巴瘤化療患者使用GnRH－a不能保護(hù)卵巢功能和提高妊娠率［25］。Chen等［26］對多個隨機(jī)對照試驗分析認(rèn)為，GnRH－a在化療中可以保護(hù)卵巢功能，但對于生育力的保護(hù)尚缺乏足夠證據(jù)。目前關(guān)于GnRH－a對生育力保護(hù)的效果存在較多爭議，ASCO最新指南指出，不推薦其作為腫瘤患者保護(hù)生育力的有效方法，只有當(dāng)其它方法都不可行時再考慮使用［20］。

4．卵巢移位：卵巢移位是指通過手術(shù)將卵巢暫時移至放療區(qū)域之外，可以一定程度保護(hù)盆腔放療患者卵巢免遭損害，待放療結(jié)束后適當(dāng)時機(jī)可選擇將卵巢移回盆腔或進(jìn)行體外受精。根據(jù)不同的研究結(jié)果，卵巢移位對保存生育力的成功率為50%～95%不等，與放療劑量、放療面積和次數(shù)、是否聯(lián)合化療以及患者年齡相關(guān)［4］。該方法只適用于盆腔放療的患者，而且手術(shù)有導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，所以最好在放療要開始前進(jìn)行手術(shù)，并充分告知患者風(fēng)險［12］。

對于攜帶有腫瘤易感基因的腫瘤患者，可通過植入前遺傳學(xué)診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）選擇不攜帶相關(guān)易感基因的胚胎。PGD已被應(yīng)用于數(shù)十種遺傳性癌癥易感疾病，包括早發(fā)性高外顯率疾病如李－佛美尼綜合癥、家族性腺瘤樣息肉病等，和低外顯率遲發(fā)性疾病，如與BRCA1／2相關(guān)的遺傳性乳腺癌卵巢癌綜合征（HBOC）［27］。歐洲人類生殖及胚胎學(xué)會（ESHRE）和英國人類受精和胚胎學(xué)管理局（HFEA）認(rèn)為PGD可應(yīng)用于HBOC一類遲發(fā)性疾?。?8］。但因遺傳性易感癌癥的外顯率、發(fā)病年齡和現(xiàn)有預(yù)防治療措施各不相同，是否應(yīng)該執(zhí)行PGD目前尚存在諸多爭議。對這部分腫瘤患兒進(jìn)行生育力保存時，應(yīng)同時接受遺傳咨詢，充分告知患者病情、PGD技術(shù)的利弊以及后代的患病風(fēng)險。

三、挑戰(zhàn)與展望

卵巢組織再移植有腫瘤細(xì)胞再種植的風(fēng)險，尤其是在血液腫瘤患者中［29］。對于只能選擇OTC的患者，如何更好地保存生育力是現(xiàn)在面臨的主要問題。學(xué)者們提出將卵巢組織中竇前卵泡分離出來，在體外培養(yǎng)至成熟進(jìn)行體外受精，也可用從冷凍卵巢組織中分離出來的竇前卵泡和生物材料構(gòu)建人工卵巢。這樣既可避免腫瘤再種植風(fēng)險，又保存利用了卵巢中大量未成熟卵泡［14］。結(jié)合3D培養(yǎng)的卵泡多階段體外培養(yǎng)體系已經(jīng)成功建立在多個物種中，小鼠中已可以從原始卵泡體外培養(yǎng)至活產(chǎn)［30］，靈長類動物可以次級卵泡培養(yǎng)至桑葚胚階段［31］，在人類有報道從原始或次級卵泡培養(yǎng)至成熟卵泡［32－33］。

人工卵巢指是用生物材料構(gòu)建一個可以供卵泡生長的基質(zhì)環(huán)境，將竇前卵泡放置在其中，再移植回體內(nèi)繼續(xù)生長［34］。從人凍融卵巢組織中分離出來的卵泡包裹于纖維蛋白支架中，移植到裸鼠體內(nèi)7d后約有20%存活［35］。近期有報道通過3D打印技術(shù)與小鼠卵泡構(gòu)建的人工生物卵巢，移植到絕育小鼠體內(nèi)后，不但發(fā)揮了內(nèi)分泌功能，而且有3只受體小鼠自然懷孕并產(chǎn)生后代［36］。人工卵巢技術(shù)在小鼠中取得重大成果，但在大型哺乳動物和人中尚處于初步研究階段。除此之外Hikabe等［37］利用小鼠的多能干細(xì)胞，在體外成功誘導(dǎo)了卵子的發(fā)生和發(fā)育成熟過程，并最終有活產(chǎn)產(chǎn)生，這將是未來保存生育力的一個重要研究方向。

四、結(jié)語

隨著兒童和青少年腫瘤患者生存時間延長，保存生育力是保障成年后生活質(zhì)量的重要措施，也受到越來越多人的關(guān)注。每位腫瘤患者在治療前都應(yīng)進(jìn)行生育力保存的相關(guān)咨詢，但因為信息缺乏、醫(yī)療資源不足、腫瘤帶來的壓力和經(jīng)濟(jì)倫理等問題，目前在治療前接受生育力保存咨詢的患者只有一小部分，最終進(jìn)行有效生育力保存的人更是少數(shù)。卵子冷凍是進(jìn)入青春期后、抗腫瘤治療可以推遲2～3周和可以耐受COS的患者保存生育力的標(biāo)準(zhǔn)方案。而青春期前和抗腫瘤治療不能推遲的患者，OTC是主要方法。應(yīng)用GnRH－a卵巢抑制和卵巢移位對生育力的保存效果存在很大的不確定性，不推薦作為有效方法，當(dāng)不得不選用這兩種方法時應(yīng)充分告知患者存在的風(fēng)險。竇前卵泡分離體外培養(yǎng)和人工卵巢技術(shù)是未來保存生育力的發(fā)展方向，有很廣闊的應(yīng)用前景，如何提高原始卵泡的成熟率、建立高效完整的培養(yǎng)體系、構(gòu)建人工卵巢等問題都還需要解決。除此之外，還應(yīng)提高臨床醫(yī)生和患者及家屬關(guān)注生育力保存的意識，優(yōu)化診療體系，這對兒童和青少年腫瘤患者生育力的保存也至關(guān)重要。