姚志鴻，熊風(fēng)，李觀貴，孫青，萬(wàn)才云，陳培林，鐘惠嫻，曾勇

（深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045）

體外受精／卵胞漿內(nèi)單精子注射－胚胎移植（IVF／ICSI－ET）是治療不孕不育癥的有效手段，胚胎培養(yǎng)是IVF／ICSI－ET中最主要的環(huán)節(jié)，提高胚胎體外發(fā)育潛能和質(zhì)量至關(guān)重要。胚胎是一種具有分泌活性的生物體，研究表明，種植前的胚胎能夠分泌產(chǎn)生各種不同的配體分子，包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、激素類分子等［1］，并且這些分子可能影響相鄰胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育，因此，基礎(chǔ)研究理論認(rèn)為胚胎集合培養(yǎng)可能優(yōu)于單胚胎培養(yǎng)［2］。然而，目前相關(guān)的臨床研究報(bào)道較少，結(jié)論也未達(dá)成一致［3］。考慮到優(yōu)質(zhì)胚胎是目前認(rèn)為分泌“功能分子”促進(jìn)胚胎共同發(fā)育的關(guān)鍵［4］，因此，本研究選取IVF／ICSI治療的患者優(yōu)質(zhì)胚胎為研究對(duì)象，分析不同培養(yǎng)方法對(duì)其囊胚培養(yǎng)結(jié)局及移植后臨床結(jié)局的影響。

資料與方法

一、研究對(duì)象

本研究選取2018年3～10月在本中心接受IVF／ICSI治療的患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：女方年齡＜38歲；常規(guī)促排卵方案；第1個(gè)IVF或ICSI周期；第3天（Day 3）優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)≥4枚；第5天（Day 5）新鮮單囊胚移植。排除因OHSS風(fēng)險(xiǎn)、子宮內(nèi)膜因素、孕酮高水平等因素取消新鮮周期移植的患者。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，入選206位患者（206個(gè)周期），共計(jì)優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎1 281枚。

二、研究方法

1．分組：因工作流程變化，2018年7月1日起，本中心對(duì)卵裂期胚胎的囊胚培養(yǎng)方式由集合培養(yǎng)改變?yōu)閱闻咛ヅ囵B(yǎng)，以此為時(shí)間節(jié)點(diǎn)，將入選人群分為A、B兩組：A組采用單胚胎培養(yǎng)法（后4個(gè)月，n＝118），即1個(gè)微滴培養(yǎng)1枚胚胎；B組采用集合培養(yǎng)法（前4個(gè)月，n＝88），即1個(gè)微滴培養(yǎng)2～3枚胚胎。

2．促排卵和受精：根據(jù)患者情況和本中心的標(biāo)準(zhǔn)采用常規(guī)方案促排卵，當(dāng)18mm以上卵泡≥2個(gè)時(shí)，肌肉注射HCG（珠海麗珠制藥），34～36h后經(jīng)陰道B超穿刺取卵。男方精液采用不連續(xù)密度梯度離心法處理，取卵后4～6h進(jìn)行IVF或ICSI受精。

3．卵裂期胚胎培養(yǎng)與質(zhì)量評(píng)估：卵裂期胚胎培養(yǎng)兩組均采用單胚胎培養(yǎng)法，培養(yǎng)液為Quinn’s 1026培養(yǎng)液（SAGE，美國(guó)），培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、5%O2。受精后第3天采用形態(tài)學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)胚胎進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估［5］：1級(jí)：卵裂球數(shù)目≥7個(gè)，碎片數(shù)量≤10%；2級(jí)：卵裂球數(shù)目≥7個(gè)，10%＜碎片數(shù)量≤20%；3級(jí)：卵裂球數(shù)目≥7個(gè)，碎片數(shù)量＞20%或5個(gè)≤卵裂球數(shù)目＜7個(gè)，碎片數(shù)量≤10%；4級(jí)：5個(gè)≤卵裂球數(shù)目＜7個(gè)，碎片數(shù)量＞10%或卵裂球數(shù)目＜5個(gè)。正常受精且Day 3為1級(jí)或2級(jí)的胚胎定義為優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎。

4．囊胚培養(yǎng)與質(zhì)量評(píng)估：囊胚培養(yǎng)采用Quinn’s 1029培養(yǎng)液（SAGE，美國(guó)），培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、5%O2，培養(yǎng)方式為微滴培養(yǎng)，微滴體積為25～30μl。其中，A組患者每個(gè)微滴培養(yǎng)1枚優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎；B組患者每個(gè)微滴培養(yǎng)3枚或2枚優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎。胚胎培養(yǎng)第5天和第6天分別觀察囊胚形成情況并采用Gardner評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［6］對(duì)囊胚質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，將3期及3期以上擴(kuò)張程度，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層評(píng)分均達(dá)到C級(jí)以上定義為優(yōu)質(zhì)囊胚；將3期及3期以上擴(kuò)張程度，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層評(píng)分至少一個(gè)達(dá)到C級(jí)以上定義為可利用囊胚，即可用于移植及冷凍。

5．新鮮囊胚移植與黃體支持：胚胎培養(yǎng)第5天在B超介導(dǎo)下行新鮮單囊胚移植。黃體支持采用黃體酮凝膠（默克雪蘭諾，瑞士），陰道給藥90mg／d。直至移植后11d抽血檢測(cè)HCG。

6．妊娠診斷：囊胚移植后第11天檢測(cè)血HCG，HCG≥5U／L定義為HCG陽(yáng)性。移植后30d經(jīng)B超檢查見宮腔內(nèi)有妊娠囊及胎心搏動(dòng)判斷為臨床妊娠。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18．0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，率的差異性分析采用χ2檢驗(yàn)；P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組患者的基本資料

A、B兩組間女方年齡、體重指數(shù)（BMI）、獲卵數(shù)以及受精率、和優(yōu)質(zhì)胚胎率均無(wú)顯著性差異（P＞0．05）（表1）。

二、兩組患者的囊胚培養(yǎng)結(jié)局

A組患者培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎696枚，B組患者培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎585枚。兩組患者囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率、可利用囊胚形成率、Day5囊胚形成率和Day6囊胚形成率均無(wú)顯著性差異（P＞0．05）（表2）。

三、兩組患者移植后臨床結(jié)局比較

統(tǒng)計(jì)分析A、B兩組患者的臨床妊娠情況顯示，兩組的HCG陽(yáng)性率、臨床妊娠率、繼續(xù)妊娠率和早期流產(chǎn)率均無(wú)顯著性差異（P＞0．05）（表3）。

表1 兩組患者基本資料比較［（），%］

表1 兩組患者基本資料比較［（），%］

組 別 周期數(shù) 女方年齡 BMI（kg／m2） 獲卵數(shù) 受精率 優(yōu)質(zhì)胚胎率 移植優(yōu)胚數(shù)A組 118 31．60±3．26 21．65±3．52 14．59±3．40 80．84（1 392／1 722） 67．01（908／1 355）88．14（104／118）B組 88 31．17±3．49 21．68±2．94 14．00±3．22 82．47（1 016／1 232） 67．56（681／1 008）92．05（81／88）

表2 兩組患者的囊胚形成情況比較［n（%）］

表3 兩組患者移植后臨床妊娠情況比較（%）

討 論

改善胚胎培養(yǎng)結(jié)局，提高臨床妊娠率是每個(gè)生殖中心研究的方向與重點(diǎn)，建立一套正確的胚胎培養(yǎng)策略對(duì)于提高培養(yǎng)效果能起到一個(gè)舉足輕重的作用。目前大多數(shù)生殖中心為了方便追蹤胚胎的個(gè)體發(fā)育情況，囊胚培養(yǎng)一般采用單胚胎培養(yǎng)的方式［7］，但許多研究表明胚胎在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可以分泌出許多促進(jìn)胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)發(fā)育，加速囊胚形成的生長(zhǎng)因子［8－9］，而 同 時(shí) 國(guó) 外 許 多 報(bào) 道 中 對(duì) 小 鼠［10］、綿羊［11］、奶牛［12－14］等動(dòng)物通過(guò)集合培養(yǎng)的方法進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，顯著改善了動(dòng)物囊胚培養(yǎng)結(jié)局，提示集合培養(yǎng)或許可以成為改善胚胎培養(yǎng)結(jié)局的方法之一。

近年，國(guó)外學(xué)者 Ebner等［15］和 Bo等［16］均以集合培養(yǎng)和單胚胎培養(yǎng)的方式培養(yǎng)胚胎，以30μl的培養(yǎng)液體積培養(yǎng)于培養(yǎng)液微滴中，集合培養(yǎng)組的培養(yǎng)密度為3～5個(gè)胚胎／ml和1～4個(gè)胚胎／30μl，發(fā)現(xiàn)集合培養(yǎng)相較單胚胎培養(yǎng)的確可獲得較高囊胚形成率。究其原因很可能是由于胚胎之間通過(guò)自分泌或旁分泌的形式促進(jìn)相鄰胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育，而集合培養(yǎng)的胚胎相較于單胚胎培養(yǎng)不僅可以加強(qiáng)胚胎之間的交流作用，而且由于培養(yǎng)密度的增大可以提高胚胎分泌于培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)因子的濃度，從而改善胚胎的囊胚培養(yǎng)結(jié)局。而Tao等［17］將Day 3卵裂期胚胎以2～5個(gè)胚胎／50μl的胚胎密度分為A、B組進(jìn)行集合培養(yǎng)，A組為隨機(jī)分配胚胎集合培養(yǎng)，B組為Day 3優(yōu)質(zhì)胚胎集合培養(yǎng)和Day 3非優(yōu)質(zhì)胚胎分別集合培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)集合培養(yǎng)的胚胎中，B組較A組的囊胚形成率和優(yōu)質(zhì)囊胚形成率有顯著性的提高，這提示優(yōu)質(zhì)胚胎可以更有效分泌有益因子或降低不良因子對(duì)鄰近胚胎的影響，從而提高了整體囊胚形成水平。

本次研究的206例案例中，主要研究對(duì)象為Day3優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎，按1～3個(gè)胚胎／25μl的培養(yǎng)密度分組培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)集合培養(yǎng)組相較于單胚胎培養(yǎng)組的囊胚形成率、可利用囊胚率和優(yōu)質(zhì)囊胚率均無(wú)顯著性差異（P＞0．05），表明集合培養(yǎng)并不能有效地改善優(yōu)質(zhì)胚胎的囊胚培養(yǎng)結(jié)局。這與上述報(bào)道中提到的關(guān)于集合培養(yǎng)改善胚胎培養(yǎng)結(jié)局的結(jié)論不一致，經(jīng)過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)各研究中均采用不同的胚胎培養(yǎng)密度，而 Minasi等［18］和 Munck等［19］則在研究中提到過(guò)胚胎培養(yǎng)密度的改變可能會(huì)影響囊胚形成率，這可能是導(dǎo)致上述研究結(jié)果不一致的原因之一。

至于兩組間的新鮮單囊胚移植后的臨床結(jié)局，我們通過(guò)對(duì)比后發(fā)現(xiàn)集合培養(yǎng)組相較單胚胎培養(yǎng)組的HCG陽(yáng)性率、臨床妊娠率和繼續(xù)妊娠率均有所提高，但均無(wú)顯著性差異（P＞0．05）。這與過(guò)去報(bào)道基本一致［20－21］，即與單胚胎培養(yǎng)法相比，集合培養(yǎng)法無(wú)法有效地改善胚胎臨床結(jié)局?；蛟S集合培養(yǎng)存在兩面性：胚胎雖然通過(guò)旁分泌的方式產(chǎn)生生長(zhǎng)因子促進(jìn)鄰近胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育［22］，但同時(shí)集合培養(yǎng)可能會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育過(guò)程中分泌的胚胎廢棄物如氨基酸、銨、活性氧等有毒物質(zhì)大量聚集［23－26］，從而影響胚胎發(fā)育潛能，無(wú)法改善胚胎的臨床結(jié)局。

綜上所述，雖然實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過(guò)程中采用先后時(shí)間段不同進(jìn)行分組而未進(jìn)行隨機(jī)分組，但實(shí)驗(yàn)中使用的培養(yǎng)液質(zhì)控正常，并且培養(yǎng)胚胎的天數(shù)和相關(guān)實(shí)驗(yàn)人員等實(shí)驗(yàn)條件并未改變，所以本實(shí)驗(yàn)誤差對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果而言影響相對(duì)較小。最終結(jié)果表明對(duì)于Day 3優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎，集合培養(yǎng)無(wú)法有效地改善胚胎囊胚發(fā)育潛能及臨床結(jié)局，相較于單胚胎培養(yǎng)意義不大。采用單胚胎培養(yǎng)法培養(yǎng)胚胎時(shí)，不僅可以更好地追蹤胚胎個(gè)體的發(fā)育，提高移植胚胎的準(zhǔn)確性，同時(shí)可以觀察到發(fā)育異常的胚胎從而篩選出發(fā)育良好的胚胎。所以培養(yǎng)Day 3優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎時(shí)，單胚胎培養(yǎng)法會(huì)是一個(gè)更好的選擇。而對(duì)于非優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎，由于本研究只開展了Day3優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎，未對(duì)非優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，所以尚需更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證對(duì)于非優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎是否存在著同等效應(yīng)。