何于夏，劉海英，李莉，鄭海燕

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 廣東省生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省普通高校生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510150）

隨著輔助生殖技術(shù)的廣泛應(yīng)用，多胎妊娠的發(fā)生率逐漸增高，多胎妊娠可增加母嬰并發(fā)癥、流產(chǎn)和早產(chǎn)的發(fā)生率、圍產(chǎn)兒患病率和死亡率［1－2］。為了降低母嬰并發(fā)癥，改善圍產(chǎn)兒結(jié)局，國內(nèi)外專家推薦優(yōu)質(zhì)單囊胚移植，不僅可獲得與雙囊胚移植類似的妊娠結(jié)局，還可以顯著降低多胎率的發(fā)生［3－4］。文獻(xiàn)報(bào)道非優(yōu)質(zhì)雙囊胚移植多胎率仍可達(dá)25%～33%［3，5］，目前非優(yōu)質(zhì)單囊胚移植亦可獲得較好的妊娠結(jié)局［6］。因此，非優(yōu)質(zhì)單囊胚移植也逐漸被越來越多的輔助生殖中心接受。對于非優(yōu)質(zhì)囊胚，當(dāng)囊胚評分不平行時(shí)，優(yōu)先根據(jù)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或滋養(yǎng)外胚層評分挑選發(fā)育潛能較佳的囊胚，且不同優(yōu)先策略與妊娠結(jié)局及新生兒出生情況的關(guān)系目前報(bào)道不多。另外，關(guān)于囊胚發(fā)育時(shí)間與妊娠結(jié)局的關(guān)系，文獻(xiàn)報(bào)道也存在諸多爭議［7－8］。因此，本研究綜合囊胚發(fā)育時(shí)間和囊胚形態(tài)學(xué)評分比較非優(yōu)質(zhì)單囊胚凍融移植（FET）周期妊娠結(jié)局及新生兒出生情況的差異，為臨床移植策略提供參考。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2014年1月至2018年7月于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心實(shí)施非優(yōu)質(zhì)單囊胚FET周期的共333例患者的臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：非優(yōu)質(zhì)單囊胚移植；囊胚擴(kuò)張4期及4期以上；女方年齡小于35歲；決定日子宮內(nèi)膜厚度≥7mm。排除標(biāo)準(zhǔn)：已知的子宮畸形；輸卵管積水、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜息肉、宮腔粘連；未治療的甲狀腺疾病或高催乳素血癥。

根據(jù)囊胚發(fā)育天數(shù)和囊胚質(zhì)量將非優(yōu)質(zhì)單囊胚移植患者分為4組：D5－AC／BC組（120例）；D5－CA／CB組（21例）；D6－AC／BC 組（163例）；D6－CA／CB組（29例）。

二、研究方法

1．治療方案：根據(jù)患者年齡和卵巢儲(chǔ)備等情況選擇合適的促排卵方案。當(dāng)2～3個(gè)主導(dǎo)卵泡平均直徑≥18mm時(shí)，予HCG（珠海麗珠醫(yī)藥）6 000U～10 000U，36～38h后經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下取卵。獲得的卵母細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，依據(jù)患者當(dāng)天精液質(zhì)量，選擇常規(guī)體外受精（IVF）或卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）授精。

2．囊胚培養(yǎng)及評分：經(jīng)知情告知并簽署知情同意書后，挑選1～2個(gè)第3天（D3）胚胎用于移植或冷凍，剩下的胚胎選擇繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚階段。受精后第5天（D5）及第6天（D6）觀察囊胚形態(tài)，按照Gardner評分標(biāo)準(zhǔn)［9］進(jìn)行囊胚評級(jí)。本中心優(yōu)質(zhì)囊胚的標(biāo)準(zhǔn)定義為4期及以上囊胚、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）及滋養(yǎng)層細(xì)胞（TE）均為B級(jí)及以上者；非優(yōu)質(zhì)囊胚的標(biāo)準(zhǔn)包括3期囊胚，ICM或TE評分為C級(jí)的4期及以上囊胚。本研究納入的非優(yōu)質(zhì)囊胚為4期及4期以上的AC／BC、CA／CB胚胎。

3．囊胚冷凍與復(fù)蘇：本實(shí)驗(yàn)室采用玻璃化冷凍方法進(jìn)行囊胚冷凍。冷凍及復(fù)蘇操作均按照日本加藤公司的玻璃化冷凍、解凍試劑盒說明書進(jìn)行。復(fù)蘇后的囊胚移入囊胚培養(yǎng)液中，置于37℃、6%CO2環(huán)境中等待移植。

4．子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備：子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案包括自然周期（NC）方案和激素替代治療（HRT）方案。NC適用于有規(guī)律月經(jīng)周期的患者；HRT適用于月經(jīng)周期不規(guī)律或自然周期中子宮內(nèi)膜發(fā)育不良的患者。在黃體酮注射6d后或排卵6d后進(jìn)行超聲引導(dǎo)下的囊胚移植。移植后常規(guī)行黃體支持。

5．妊娠結(jié)局的判斷：移植后28d陰道超聲見宮內(nèi)孕囊者為臨床妊娠。妊娠不足28周終止為流產(chǎn)，其中于12周前終止者為早期流產(chǎn)?；町a(chǎn)為孕期滿28周或胎兒體重達(dá)1 000g，胎兒娩出后至少具有生命體征（心跳、呼吸、臍帶搏動(dòng)、隨意肌收縮）之一。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間均數(shù)比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料以率表示，率的比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般基線資料比較

患者的年齡、不孕年限、體重指數(shù)（BMI）、不孕類型構(gòu)成、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、內(nèi)膜厚度和胚胎形態(tài)構(gòu)成在4組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）（表1）。

表1 各組患者基本情況的比較［（），n（%）］

表1 各組患者基本情況的比較［（），n（%）］

不孕類型原發(fā) 繼發(fā)D5－AC／BC 120 29．65±2．86 3．85±2．27 21．38±2．64 65（54．17） 55（45．83）D5－CA／CB 21 28．81±3．14 3．69±2．40 21．31±3．01 10（47．62） 11（52．38）D6－AC／BC 163 30．04±3．12 4．00±2．39 21．47±2．95 100（61．35） 63（38．65）D6－CA／CB 29 30．41＋2．59 4．33±2．35 21．48±3．56 19（65．52） 10（34．48）組 別 例數(shù) 年齡 不孕年限 BMI（kg／m2）內(nèi)膜準(zhǔn)備方案 胚胎形態(tài)NC HRT AC／CA BC／CB D5－AC／BC 120 9．03±1．43 41（34．17） 79（65．83） 7（5．83） 113（94．17）D5－CA／CB 21 9．34±1．47 6（28．57） 15（71．43） 1（4．76） 20（95．24）D6－AC／BC 163 9．32±1．45 58（35．58） 105（64．42） 6（3．68） 157（96．32）D6－CA／CB 29 8．90±1．71 14（48．28） 15（51．72） 1（3．45） 28（96．55）組 別 例數(shù) 內(nèi)膜厚度（mm）

二、不同胚胎質(zhì)量和發(fā)育速度的非優(yōu)質(zhì)單囊胚移植臨床結(jié)局的比較

當(dāng)胚胎質(zhì)量相同時(shí)，無論是AC／BC組還是CA／CB組患者，D5組囊胚的臨床妊娠率顯著高于D6組（P＜0．05）。D5－AC／BC組的活產(chǎn)率顯著高于 D6－AC／BC組（P＜0．05），D5－CA／CB組的活產(chǎn)率雖高于D6－CA／CB組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。當(dāng)非優(yōu)質(zhì)囊胚發(fā)育速度相同時(shí)，無論是D5還是D6囊胚，AC／BC組患者的臨床妊娠率、活產(chǎn)率與CA／CB組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。流產(chǎn)率、早期流產(chǎn)率、早產(chǎn)率、新生兒出生孕周、新生兒體重、低體重兒發(fā)生率在4組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）（表2）。

表2 不同胚胎質(zhì)量和發(fā)育速度的非優(yōu)質(zhì)單囊胚移植臨床結(jié)局的比較［（），%］

表2 不同胚胎質(zhì)量和發(fā)育速度的非優(yōu)質(zhì)單囊胚移植臨床結(jié)局的比較［（），%］

注：與 D5－AC／BC組比較，＊P＜0．05；與 D5－CA／CB組比較，＃P＜0．05

組 別 例數(shù) 臨床妊娠率 流產(chǎn)率 早期流產(chǎn)率 活產(chǎn)率D5－AC／BC 120 50．8（61／120） 24．6（15／61） 23．0（14／61） 38．3（46／120）D5－CA／CB 21 47．6（10／21） 30．0（3／10） 30．0（3／10） 33．3（7／21）D6－AC／BC 163 22．1（36／163）＊ 30．6（11／36） 25．0（9／36） 15．3（25／163）＊D6－CA／CB 29 24．1（7／29）＃ 28．6（2／7） 28．6（2／7） 17．2（5／29）組 別 例數(shù) 早產(chǎn)率 出生孕周 新生兒體重（g） 低體重兒發(fā)生率D5－AC／BC 120 10．9（5／46） 39．0±1．6 3 227．4±432．7 8．7（4／46）D5－CA／CB 21 14．3（1／7） 38．8±2．0 3 400．0±512．4 0（0／7）D6－AC／BC 163 8．0（2／25） 39．0±2．0 3 422．8±481．2 4．0（1／25）D6－CA／CB 29 0（0／5） 38．8±0．5 3 280．0±175．4 0（0／5）

討 論

多胎妊娠是輔助生殖技術(shù)的一個(gè)常見并發(fā)癥，多胎妊娠孕婦發(fā)生妊娠期糖尿病、妊娠期高血壓疾病、產(chǎn)后出血等并發(fā)癥及剖宮產(chǎn)率風(fēng)險(xiǎn)顯著升高，同時(shí)也增加新生兒的早產(chǎn)率、低體重兒率、新生兒窒息、顱內(nèi)出血、死胎率等［1］。在輔助生殖領(lǐng)域，避免醫(yī)源性多胎妊娠重在預(yù)防，選擇性單胚胎移植是避免醫(yī)源性多胎妊娠發(fā)生的有力措施。為了保障單胎活產(chǎn)率，國內(nèi)外大部分生殖中心已推薦實(shí)施選擇性單囊胚移植。Wintner等［10］的研究表明優(yōu)質(zhì)單囊胚能獲得與雙囊胚移植相似的臨床妊娠率和活產(chǎn)率，且顯著降低多胎率的發(fā)生。對于無優(yōu)質(zhì)囊胚患者，臨床胚胎移植策略傾向于移植非優(yōu)質(zhì)雙囊胚提高臨床妊娠率。國內(nèi)學(xué)者汪彩珠等［5］研究發(fā)現(xiàn)非優(yōu)質(zhì)雙囊胚移植的多胎率顯著高于非優(yōu)質(zhì)單囊胚。Dobson等［3］研究亦表明在FET周期中，非優(yōu)質(zhì)單囊胚的活產(chǎn)率與非優(yōu)質(zhì)雙囊胚組相似，但可顯著降低多胎率。因此，在無優(yōu)質(zhì)囊胚移植情況下，非優(yōu)質(zhì)單囊胚移植也逐漸被臨床醫(yī)生所接受。

D5與D6囊胚移植妊娠結(jié)局的比較目前仍有爭議。囊胚培養(yǎng)系統(tǒng)與凍融處理過程的差異、不同的囊胚培養(yǎng)策略、具有較強(qiáng)主觀性的囊胚評分系統(tǒng)等均是造成不同研究中心研究結(jié)果差異的重要原因［11］。本研究中，D5組非優(yōu)質(zhì)單囊胚移植患者的臨床妊娠與活產(chǎn)率高于同質(zhì)量的D6囊胚，我們的結(jié)論與既往研究報(bào) 道［11－12］一 致。Yang等［11］對 237個(gè)囊胚進(jìn)行胚胎植入前遺傳學(xué)篩查（PGS），發(fā)現(xiàn)D5優(yōu)質(zhì)囊胚的整倍體率與D6優(yōu)質(zhì)囊胚無明顯差異（55．2%vs．55．3%，P＞0．05），而 D5非優(yōu)質(zhì)囊胚的整倍體率高于D6非優(yōu)質(zhì)囊胚，雖未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能也是造成D6非優(yōu)質(zhì)囊胚妊娠率較低的原因。其他研究認(rèn)為不同發(fā)育速度的囊胚的非整倍體率無明顯差異，但并未根據(jù)囊胚質(zhì)量分層進(jìn)一步比較分析［13］。因此，囊胚的發(fā)育速度對于優(yōu)質(zhì)囊胚發(fā)育潛能的預(yù)測價(jià)值可能不大，而對于非優(yōu)質(zhì)囊胚的發(fā)育潛能可能有著一定的預(yù)測價(jià)值［12］。在患者無優(yōu)質(zhì)囊胚情況下，建議優(yōu)先選擇D5非優(yōu)質(zhì)囊胚移植。

囊胚形態(tài)學(xué)評分通常采用Gardner評分法［9］，囊胚形態(tài)各評價(jià)指標(biāo)對妊娠結(jié)局的影響，國內(nèi)外文獻(xiàn)存在爭議。Du等［14］研究發(fā)現(xiàn)在新鮮或凍融單胚胎移植中，囊胚擴(kuò)張程度是唯一預(yù)測活產(chǎn)率的指標(biāo)，ICM及TE評分均不能預(yù)測活產(chǎn)率；Subira等［15］認(rèn)為囊胚的ICM質(zhì)量對活產(chǎn)率有更好的預(yù)測價(jià)值，而TE與臨床結(jié)局無關(guān)；Chen等［16］則認(rèn)為TE質(zhì)量而不是ICM質(zhì)量與臨床妊娠率和活產(chǎn)率顯著相關(guān)。由于文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果的不一致性，在進(jìn)行非優(yōu)質(zhì)單囊胚移植的胚胎選擇時(shí)，若ICM、TE的評分不平行時(shí)，選擇ICM較佳的囊胚還是TE較佳的囊胚進(jìn)行移植，給臨床胚胎移植策略上帶來了困惑。國內(nèi)學(xué)者何冰等［17］研究發(fā)現(xiàn)CA／CB囊胚組獲得與AC／BC組相似的臨床妊娠率與早期流產(chǎn)率。本研究發(fā)現(xiàn)，在相同的囊胚發(fā)育速度下，AC／BC組囊胚的臨床妊娠率、活產(chǎn)率、早期流產(chǎn)率與CA／CB組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究中各組的早期流產(chǎn)率均達(dá)20%以上，提示了無論ICM還是TE在胚胎整個(gè)發(fā)育過程中都具有極其重要的作用。

本研究根據(jù)非優(yōu)質(zhì)囊胚發(fā)育速度和形態(tài)學(xué)將患者分為了4組，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)新生兒早產(chǎn)率、出生孕周、新生兒體重及低體重兒的發(fā)生率在4組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示了無論是AC／BC還是CA／CB囊胚，D6囊胚的臨床妊娠率雖顯著低于D5組，但是一旦達(dá)到持續(xù)妊娠，可以獲得相似的新生兒出生結(jié)局，但不能排除由于樣本量較少而得不到有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。另外，Oron等［18］研究也表明非優(yōu)質(zhì)胚胎并未與負(fù)面的產(chǎn)科和圍產(chǎn)期結(jié)局相關(guān)。因此，施行非優(yōu)質(zhì)單囊胚移植，可降低多胎率、改善圍產(chǎn)期母嬰結(jié)局，獲得與優(yōu)質(zhì)胚胎相似的良好的圍產(chǎn)期結(jié)局。

本研究還存在諸多不足。首先，各組納入樣本量不均，得出的研究結(jié)果可能存在一定偏倚，需要進(jìn)一步研究觀察；另外，臨床上考慮到ICM以后發(fā)育成胎兒，質(zhì)量較差可能會(huì)影響到以后胎兒發(fā)育，在胚胎移植策略上可能傾向于選擇ICM較好的囊胚進(jìn)行移植，這可能也是造成樣本量不均的一個(gè)重要原因。

綜上所述，在非優(yōu)質(zhì)單囊胚移植周期中，優(yōu)先選擇發(fā)育快的D5囊胚，可獲得較好的臨床妊娠率與活產(chǎn)率。當(dāng)囊胚ICM、TE評分不平行時(shí)不顯著影響妊娠結(jié)局及新生兒出生情況。